[发明专利]快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2）和N-末端脑钠肽（NT-proBNP）的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片（4）以及试纸条支撑片（4）上顺次搭接粘贴的样品垫片（1）、检测膜（2）和吸水垫片（3），所述样品垫片（1）和检测膜（2）之间设有偶合物垫片（5），所述的偶合物垫片（5）一端上方设有第一层玻璃纤维垫片（6-1），其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片（6-2）或者偶合物垫片（5）一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片（6-1）或者不设有任一垫片，其特征在于：所述检测膜（2）上设有检测线1（7-1）、检测线2（7-2），所述检测线1（7-1）包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线2（7-2）包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述的检测线1（7-1）、检测线2（7-2）设在检测膜（2）的同一位置或设在相邻位置，若为不同位置，则检测线1（7-1）、检测线2（7-2）均位于控制线（8）同一侧，控制线（8）包被有抗链霉亲和素（SAV）抗体，所述偶合物垫片（5）上涂布有含有不同荧光标记的ST2抗体和NT-proBNP抗体偶合物，

所述偶尔物垫片（5）中的含有不同荧光标记的ST2抗体偶合物和NT-proBNP抗体偶合物通过如下步骤制成：

1）Dye-649 NHS Ester-ST2抗体偶合物以及Biotin-NT-proBNP抗体的制备

1.1）Dye-649 NHS Ester-ST2抗体偶合物的制备：

ST2抗体溶于碳酸盐缓冲液（0.5M Boarte buffer, pH=8.5）中，活化的Dye-649 NHS Ester溶解于二甲基亚砜（DMSO）中溶解，然后把ST2抗体加入碳酸盐缓冲液（0.5M Boarte buffer, pH=8.5）中混匀后，加入准备好的Dye-649 NHS Ester溶液，37度反应1小时，反应完成后，将偶合物溶液转移至超滤管中进行纯化，并多次用1XPBS磷酸盐缓冲液冲洗，直至超滤管的底部无游离的荧光分子，并计算纯化后的Dye-649 NHS Ester-ST2抗体偶合物的标记个数；

1.2）Biotin-NT-proBNP抗体的制备：

NT-proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，活化的生物素（Biotin）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中保证其活化度，然后把生物素（Biotin）加入溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素（Biotin），并计算每个NT-proBNP抗体可能结合的生物素（Biotin）个数；

2）DyLight-800 NHS Ester-SAV的制备：

抗链霉亲和素（SAV）粉末溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的抗链霉亲和素（SAV）快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液（0.05M Borate buffer）进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800 NHS Ester-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素（SAV）的标记个数；

3）DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP抗体偶合物的制备：

DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP偶合物的制备方法：按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800 NHS Ester-SAV和Biotin-NT-proBNP抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS , Biotin-NT-proBNP和DyLight-800 NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率（T%），并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP。