[发明专利]一种海鞘多肽CS5931的制备方法

权利要求书

1.一种海鞘多肽CS5931的制备方法，包括重组海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性，其特征在于：

所述的重组海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码海鞘多肽CS5931的基因连接入含有分子伴侣pG-KJE8的质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21构成工程菌BL21/pET21a-CS5931，将BL21/pET21a-CS5931接种在含有氨苄的LB培养基中进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h时加入L-阿拉伯糖、四环素及IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5-8.5h；

IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量体积比在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量体积比在20-45％；所述加入IPTG后的发酵温度为23℃-30℃；

所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过镍离子金属螯合层析方法纯化重组海鞘多肽CS5931的可溶性表达组分；利用组氨酸侧链上的咪唑基与金属离子Ni²⁺螯合的特性，使带有His标签的重组海鞘多肽CS5931得到分离，并利用60-75mM咪唑缓冲液洗涤杂蛋白，250-350mM咪唑缓冲液洗脱目的多肽CS5931，使目的蛋白得到纯化；

所述的变性复性：向洗脱得到的目的蛋白溶液中分次缓慢加入8M尿素，1-3mM L-半胱氨酸，0.3-0.6mM L-精氨酸，0.3-0.6mM EDTA，反应3-5h；多肽样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24-30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性液更换为透析液，透析3-5h，将透析完成的样品加入1-2倍于样品多肽的甘露醇后冻干得到纯化后的海鞘多肽CS5931。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述IPTG添加的终浓度为0.6mM；所述IPTG的添加时间为接种后4.5h；所述活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量体积比为4％，加入IPTG后发酵培养温度30℃，所述的BL21/pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量体积比为20％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化杂蛋白的咪唑缓冲液的浓度为65mM，洗脱目的海鞘多肽CS5931的咪唑缓冲液的浓度为300mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的复性液的成分及其终浓度为0.3-0.6mM L-精氨酸、0.5M尿素、1-3mM L-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂，0.1-0.3mM L-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作为氧化剂，还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1，上述物质溶解在TGE缓冲液中。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：取-80℃保存的甘油菌BL21/pET21a-CS5931于含100μg/mL氨苄的3mL LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h，从平板上挑含有目的基因的表达菌BL21的单菌落接于含100μg/mL氨苄的10mL LB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h，将活化的种子液以体积比4％的接种量转接入50mL LB培养基中，培养基中含有100μg/mL的氨苄和20μg/mL的氯霉素，装液量体积比为20％，37℃，200r/min培养，待OD₆₀₀达到0.6左右时加入500μg/mL的L-阿拉伯糖、1μg/mL的四环素及IPTG进行诱导，继续培养6.5h，发酵培养温度为23℃。