[发明专利]一种海鞘多肽CS5931的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于药学科学领域，具体地涉及一种海鞘多肽CS5931的制备方法

背景技术

玻璃海鞘广泛分布于山东沿海地区，它是发育与进化生物学研究的重要生物，且近年来研究发现它具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、免疫调节以及生物催化等作用，因而引起人们广泛关注。玻璃海鞘具有广泛的应用价值，因此被《Science》杂志称为生物学研究的后起之秀，具有良好的应用前景。

从萨氏海鞘(Ciona savignyi)中分离出的一种新型多肽CS5931具有显著的抗肿瘤活性，N-末端序列分析发现，CS5931与人颗粒体蛋白(granulin，GRN)有同源性。本课题组已成功通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931，其同样具有显著的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种海鞘多肽CS5931的制备方法，本发明方法对现有的通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931的发酵、分离纯化和变性复性方法进行了进一步改进，从IPTG的浓度、IPTG添加时间、诱导时间、接种量、装液量、培养温度等方面优化表达体系的发酵条件，发酵条件优化后表达收率达0.703g/L，与优化前相比提高了2.01倍，且抗肿瘤活性增强。

一种海鞘多肽CS5931的制备方法，包括重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性；

所述的重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码多肽CS5931的基因连接入含有分子伴侣pG-KJE8的质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21(DE3)构成工程菌BL21(DE3)/pET21a-CS5931(简称pET21a-CS5931,下同)，将pET21a-CS5931接种在含有氨苄的培养基上进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h时加入L-阿拉伯糖、四环素及IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5-8.5h；

所述的IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20-45％；所述IPTG加入后的发酵温度为23℃-30℃；

所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过镍离子金属螯合层析方法纯化重组萨氏海鞘多肽CS5931的可溶性表达组分；利用组氨酸侧链上的咪唑基与金属离子Ni²⁺螯合的特性，使带有His标签的重组萨氏海鞘多肽CS5931得到分离，并利用60-75mM咪唑缓冲液洗涤杂蛋白，优选为65mM，250-350mM咪唑缓冲液洗脱目的多肽CS5931，优选为300mM；使目的蛋白得到纯化；

所述的变性复性：向洗脱得到的目的蛋白溶液中分次缓慢加入8M尿素，1-3mM L-半胱氨酸，0.3-0.6mM L-精氨酸，0.3-0.6mM EDTA，反应3-5h；多肽样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24-30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性液更换为透析液，透析3-5h，将透析完成的样品加入1-2倍于样品多肽的甘露醇后冻干得到纯化后的多肽CS5931。

进一步，所述IPTG添加的终浓度为0.6mM时诱导表达效果最好；所述IPTG的添加时间为接种后4.5h；所述活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中接种量在4％，加入IPTG后发酵培养温度30℃，所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基发酵的装液量在20％；

进一步，所述的复性液的成份及其终浓度为0.3-0.6mM L-精氨酸、0.5M尿素、1-3mM L-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂，0.1-0.3mM L-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作为氧化剂，还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1，上述物质溶解在TGE缓冲液中。

TGE缓冲液的成份及其终浓度为是：0.05-0.15M Tris，0.25-0.75mM EDTA，0.05-0.15M NaCl，加1.0L蒸馏水，1M盐酸调pH到8.0，加20-100mL甘油，混匀后定容至2L。透析液的成份及其终浓度为：0.05-0.15MTris，0.3-0.6mM L-精氨酸、加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。