[发明专利]一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒

权利要求书

1.一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒中所用的检测抗原为弓形虫ROP5重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的弓形虫ROP5重组蛋白是通过以下方法制备而成：

(1)提取RH株弓形虫的DNA；

(2)根据GenBank中已发表的基因序列设计引物，PCR扩增出弓形虫ROP5基因，引物序列如下：

RH株ROP5F如SEQ ID NO1所示；

RH株ROP5R如SEQ ID NO2所示；

(3)扩增的PCR产物的回收与纯化；

(4)PCR产物与PMD-18T克隆载体连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，经过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定，筛选阳性克隆进行测序；

(5)经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切的ROP5基因片段插入表达载体pET32a中构建重组表达质粒pET32a-ROP5；

(6)将重组表达质粒pET32a-ROP5转入BL21(DE3)感受态细胞中，培养后挑取阳性质粒，酶切鉴定；

(7)将鉴定为阳性的克隆菌放入细菌到密度增殖培养基中培养，待菌液轻微混浊时，将菌液接种于自动诱导表达培养基中诱导表达；用镍柱纯化重组蛋白，得重组融合蛋白TgROP5。

3.根据权利要求2所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：步骤(2)所述的PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，61℃复性1min，72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃终延伸7min。

4.根据权利要求1所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：还包括：

1)辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG；

2)磷酸盐缓冲液为15mM PBS：具体为NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加蒸馏水定容至1000mL，调节溶液的pH值至7.4；

3)抗原包被液为50mM Tris盐酸缓冲液：具体为Tris 0.60g，NaCl 0.88g，加去离子水90mL，完全溶解后用盐酸调节pH至7.6，加去离子水定容至100ml；

4)洗涤液为15mM PBST：具体为含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；

5)样品稀释液为1％BSA-PBST：具体为BSA 1g加入100mL PBST；

6)封闭液为5％脱脂奶粉：具体为5g脱脂奶粉加入100mL PBS；

7)酶标二抗稀释液为10％胎牛血清-PBST：具体为胎牛血清10mL加入90mLPBST；

8)底物缓冲液为磷酸盐-柠檬酸缓冲液：具体为柠檬酸2.553g Na₂HPO₄·12H₂O 9.2g用去离子水定容至500mL，pH5.0，4℃保存；

9)TMB贮存液：具体为TMB 1g，DMSO 99mL，溶解后分装，4℃避光保存；

10)TMB底物显色液：具体为底物缓冲液99mL，TMB贮存液1mL，30％H₂O₂ 100μL，现配现用；

11)终止液：具体为浓硫酸21.7mL，去离子水178.3mL，将浓硫酸缓慢加入去离子水中，边加边搅拌。

5.应用权利要求1～4任一项所述的试剂盒进行犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止；

犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法的最佳的工作条件为：抗原浓度为1-25μg/mL，样品稀释50倍，酶标二抗稀释浓度为1:2000，抗原包被时间1.5h，抗原包被液是50mM Tris盐酸缓冲液，封闭时间是1h，封闭液为5％脱脂奶粉，样品稀释液为1％BSA-PBST，样品孵育时间是2.5h，酶标二抗稀释液为10％胎牛血清-PBST，酶标二抗孵育时间是30min，底物显色时间10min，阴阳临界值为0.484。

6.根据权利要求5所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

a.包被：用50mM Tris盐酸缓冲液将TgROP5重组蛋白稀释成1-25μg/mL，包被ELISA酶标板，100μL/孔，37℃孵育1.5h，甩干包被液，用洗涤液PBST洗涤3次，2min/次；

b.封闭：将每孔加300μL封闭液5％脱脂奶粉，37℃孵育1h，甩干封闭液，用PBST洗涤3次，2min/次；

c.加检测血清：将血清用1％BSA-PBST按1:50的比例稀释，设阴性和阳性对照，每孔加入100μL，37℃孵育2.5h，甩干，洗涤3次；

d.加二抗：用10％胎牛血清-PBST将兔抗犬IgG-HRP作1:2000稀释，100μL/孔，37℃孵育30min，甩干，同上洗涤3次；

e.加底物：每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物溶液，于37℃避光显色10min；

f.终止：每孔50μL加入终止液，终止反应；

g.结果判定：用酶标仪测450nm处的OD值；OD值≥0.484为阳性，OD值＜0.484为阴性。