[发明专利]一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检验检疫技术领域，具体地说涉及一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)入侵动物的有核细胞而引起的一种全球性的人兽共患寄生虫病。弓形虫是一种机会致病性寄生虫，在正常人体内不会产生明显症状，对于免疫系统缺陷的群体或者在免疫抑制的患者(如艾滋病患者、恶性肿瘤患者及刚接受器官移植的人)危害比较大，常引起严重的器官损害，是其常见的致死病因之一。弓形虫的发育过程需要两个宿主，猫是唯一的终末宿主；中间宿主分布十分广泛，几乎包括人类在内的所有温血动物、部分变温动物和一些节肢动物。两个宿主在弓形虫的传播与感染中都起着重要作用。目前弓形虫尚无特效药对其治疗，也无有效的疫苗进行预防，因此动物弓形虫感染的监测对于疾病的防控具有重要意义。

目前常用的弓形虫诊断方法主要包括病原学、分子生物学和免疫学等方法。其中病原学方法费时费力，准确性较低；分子生物学包括PCR、DNA探针和基因芯片等技术，该方法虽然敏感性和特异性高，但其操作过程复杂且仪器设备昂贵；免疫学方法有间接血凝试验(IHA)、萨宾-费尔德曼染色试验(DT)、乳胶凝集试验(LAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。IHA操作简单，对感染时间较长的血清具有较好的敏感性，但对急性感染早期的血清敏感性差，且致敏红细胞不稳定，重复性差。DT是弓形虫病特有的血清学诊断方法，该方法特异性强且敏感性高，适用于弓形虫感染的早期诊断。但诊断所用的抗原必须为活虫，安全性差，因此在我国较少应用。LAT最大的问题是特异性差，经LAT诊断的阳性血清还需做进一步的血清学试验，延长诊断时间，抑制了此方法的推广与应用。ELISA是上世纪70年代出现的一种标记免疫检测技术，经过多年来不断的完善和改进，该技术已十分成熟。ELISA操作简便，不需特殊仪器设备，样品用量少，且具有高敏感性和高特异性，判断结果容易，适合于大量样本的检测。

目前市场上存在多种诊断弓形虫的ELISA诊断试剂盒，质量参差不齐难以选择。进口弓形虫ELISA诊断试剂盒质量虽好，但是却受到运输条件和价格的限制，很难大量推广应用。因此制备一种特异、敏感、简便且适合华南本地区的弓形虫诊断试剂盒是有一定必要的。

目前弓形虫ELISA检测所用的抗原多是虫体可溶性抗原，其成分不确定，抗原制备批次间差别较大，不易标准化。随着分子生物学技术的不断发展，重组抗原以其成分确定、易标准化、特异性强等优势，在选择弓形虫诊断抗原方面应用越来越广泛。弓形虫隶属于顶复门原虫，其前端都具有棒状体(Rhoptry)、微粒体(Microsone)和致密颗粒(Dense granule)3种不同尖端复合体，可分泌三种不同的蛋白。棒状体分泌的棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)与弓形虫入侵宿主细胞有密切的关系。ROP5是弓形虫入侵宿主细胞重要的毒力因子，在弓形虫强毒株入侵宿主之前将ROP5基因敲除，结果发现弓形虫的毒力完全消失，因此得出ROP5是弓形虫感染宿主的必需毒力因子。不仅如此，ROP5还具有良好的免疫原性和免疫保护性，是一种潜在的疫苗制备、诊断候选抗原分子。

发明内容

本发明的目的是克服现有弓形虫ELISA检测技术的不足，提供一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，本检测试剂盒利用弓形虫ROP5重组蛋白作为包被抗原，为进一步开发与研究弓形虫ELISA诊断试剂盒奠定基础。

本发明的目的通过下述的技术方案实现：一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，所述的检测试剂盒中所用的检测抗原为弓形虫ROP5重组蛋白。

所述的弓形虫ROP5重组蛋白是通过以下方法制备而成：

(1)提取RH株弓形虫的DNA；

(2)根据GenBank中已发表的基因序列设计引物，PCR扩增出弓形虫ROP5基因，引物序列如下：

RH株ROP5F：5’-TATAGGATCCATGGCGACGAAGCTCG-3’；(SEQ ID NO 1)；

RH株ROP5R：5’-TATACTCGAGCTCAAGCGACTGAGGGCG-3’；(SEQ ID NO 2)。

其中，粗体部分序列为酶切位点序列；

(3)扩增的PCR产物的回收与纯化；

(4)PCR产物与PMD-18T克隆载体连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，经过BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，筛选阳性克隆进行测序；