[发明专利]一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度的液态芯片试剂盒，其特征在于：包括包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球、带孔的平台载体、脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品、脂蛋白磷脂酶A2的质控品、生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体、链霉亲和素化的藻红蛋白、样本缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微球为表面带有荧光色的聚苯乙烯磁微球，带孔的平台载体里面包被有1000-5000个微球/孔，而每个微球含有2*10^-6-5*10^-5μ的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述带孔平台载体为微孔反应板。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品和脂蛋白磷脂酶A2的质控品都是用脂蛋白磷脂酶A2纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成。

5.根据权利要求书4所述的试剂盒，其特征在于：所述脂蛋白磷脂酶A2纯品是人血浆提纯的天然脂蛋白磷脂酶A2蛋白或大肠杆菌表达的重组脂蛋白磷脂酶A2蛋白。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的标准品稀释液，是在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体中的任意一种。

8.制备如权利要求1所述的试剂盒的方法，其特征在于：包括以下步骤，以下步骤不分前后顺序：

包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球的制备：将未包被的微球中加入磷酸二氢钠缓冲液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液进行活化；然后加入特异性的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体1-125μg在4-8℃进行包被；洗涤；再加入含1-10％质量分数的动物血清蛋白的封闭液进行封闭；最后在10-100mM磷酸盐缓冲液中避光、4-8℃存放；

脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品和脂蛋白磷脂酶A2的质控品的制备：先在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成标准品稀释液；再将纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成标示浓度为0-800ng/ml的梯度浓度标准品以及80-300ng/ml的脂蛋白磷脂酶A2质控品；

生物素标记抗脂蛋白磷脂酶A2抗体：将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体与生物素按照摩尔比1:20混合，再通过纯化得到生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体；

链霉亲和素化藻红蛋白：0.5mg的链霉亲和素，加入异双功能试剂无水甲醇液，使得异双功能试剂与链霉亲和素的摩尔比为20，常温反应60min，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25mM，常温反应30min，同上过葡聚糖凝胶层析，收集蛋白峰，得到巯基化的链霉亲和素；

取0.75mg/mL衍生化的荧光藻红蛋白与0.25mg/mL巯基化的链霉亲和素按照质量浓度比是3:1混合交联，摇床低速振荡，4-8℃反应过夜；

样本缓冲液的制备：在10-100mM磷酸盐缓冲液中，加入1-10％质量分数的蛋白保护剂，0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成。

9.如权利要求8所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液购买于Pierce公司，所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白。

10.如权利要求8所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述异双功能试剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯或3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中的一种或两者混合物。