[发明专利]基于长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰制剂及其应用方法

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体、抑瘤试剂及其应用。

背景技术

人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，提示lncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着lncRNA不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现lncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。

LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤，近50年来全球肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，在女性中则占第二位。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在肺癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用lncRNA芯片，构建了肺癌活检组织及正常对照样品中lncRNA的表达谱，从中筛选了一些在肺癌中差异表达的lncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实lncRNA AFAP1-AS1(NCBI accession number:NR_026892)在肺癌中表达显著上调，针对该lncRNA的检测制剂可以用于肺癌的辅助诊断。 随后，我们进一步增加样本，在226例有临床随访资料的肺癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(in situ hybridization)的方法检测了AFAP1-AS1的表达水平，发现AFAP1-AS1表达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该lncRNA表达低的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于肺癌的预后判断。

我们通过设计并合成靶向AFAP1-AS1的短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNAs)序列，构建了靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体，转染到肺癌细胞株中，在体外培养细胞模型中证实了靶向干扰AFAP1-AS1的表达可明显抑制肺癌细胞的侵袭与转移能力。将AFAP1-AS1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1的RNA干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。

发明内容

本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体、抑瘤试剂及其应用。本发明所述的用于在肿瘤细胞中抑制AFAP1-AS1表达的制剂由靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体与多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒两个部分组成。利用AFAP1-AS1序列得到的干扰载体可以抑制AFAP1-AS1的表达，并可制备抑制肺癌细胞侵袭转移的制剂。

长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，用于制备抑制肺癌细胞侵袭转移的制剂，该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO:1所示。

上述应用中所述的制剂是针对该长链非编码RNA基因设计的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体。还可以将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。

所述的制备用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体所需的3条干扰靶点序列如下：

shRNA-1：GCAATTCACTGAGTGGTTACG

shRNA-2：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT