[发明专利]玉米转化事件“双抗12-5”及其特异性鉴定方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种玉米转化事件及其特异性鉴定方法，特别涉及一种玉米转化事件“双抗12-5”及其特异性检测方法。

(二)背景技术

玉米(Zea mays)是一种重要的作物，是世界上很多地区的主要食物来源。随着植物基因工程的发展，通过导入外源基因来进行遗传改造成为遗传育种的主要手段之一。在玉米生产中，抗虫和抗除草剂都是非常需要的农艺性状。抗虫转基因玉米能够大幅度地降低化学杀虫剂的使用量，从而降低生产成本并且减少农药对环境和农作物产品的污染。抗除草剂玉米可以大幅度降低防治杂草所需要的农业劳动力，降低劳动力的投入，减少杂草对玉米产量的影响。此外，利用除草剂防治杂草也更加有利于推广免耕技术，减少土壤和肥料的流失。因此抗虫和抗除草剂性能在玉米生产中具有突出的重要性。

转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。

目前并不清楚外源基因在植物中的插入位点整合规律，因此研发过程中需要产生大量转化体并从中筛选理想的转化事件。通常需要产生数百乃至数千的不同转化事件，并在这些转化事件中筛选出具有预期转基因表达水平和模式的单一转化事件。利用育种方法、体细胞原生质融合技术可以将该转化事件导入到不同遗传背景的玉米基因组中，从而赋予玉米抗虫抗草甘膦的能力。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种优良的转化事件“双抗12-5”，该转化事件可实现将外源基因引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因在受体玉米中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体玉米的农艺性状不会产生不良影响。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种在玉米基因组特定位点中单拷贝插入外源基因序列的玉米转化事件“双抗12-5”，所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。本发明所述转化事件是利用农杆菌侵染法，将外源抗虫抗草甘膦基因导入玉米细胞中，通过再生含有外源基因的玉米细胞获得玉米转基因群体，并利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到能够满足生产需要的玉米转化事件。

进一步，所述外源基因包括抗虫基因和抗草甘膦基因，所述抗虫基因由二个Bt基因组成，优选抗虫基因基因Cry1Ab和基因Cry2Aj融合而成，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，优选所述抗草甘膦基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

进一步，优选本发明所述外源基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种玉米转化事件“双抗12-5”特异性的PCR鉴定方法，所述用于玉米转化事件“双抗12-5”特异性PCR鉴定的引物(SP1和RB-Test是检测外源基因右侧是否与玉米基因组特异性位点连接，R1和LB-test是检测外源基因左侧是否与玉米基因组特异性位点连接)为：

SP1：5’-TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3’；

RB-Test：5’-CTCGTCATCGACCAAGTCATGAAG-3’。

R1：5’-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG-3’；

LB-test：5’-AAGACGTCCGGGGGAACCGTTGTTC-3’；

本发明所述PCR反应体系为：

PCR反应条件为：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。