[发明专利]聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂领域和基因药物载体给药领域，尤其涉及聚阴离子聚合物包裹磷酸钙纳米粒制备的基因给药载体的方法，即聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的制备方法。

背景技术

在当今社会中，基因治疗已经发展成为治疗各种癌症的新的治疗方法。在当今社会中，基因治疗已经发展成为治疗各种癌症的新的治疗方法。而siRNA作为生物药物对癌症治疗也有着很大的潜力。但是由于裸露的siRNA分子的半衰期短、不稳定性、很快被RES系统清除易脱靶以及通过细胞膜的能力弱等特性，需要开发有效的能方便使用的给药载体系统。给药载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然转染效率高，但是有着潜在的免疫原性以及价格比较贵。非病毒载体主要有脂质体、多聚阳离子聚合物、阳离子脂质纳米粒。尽管阳离子载体也有着很好的转染效率，但是同时也带来一些问题，比如本身的毒性、血液毒性、纳米粒在血浆中聚集、在细胞内siRNA不易从载体中释放出来发挥作用，,因此发展高效、多功能、低毒的siRNA载体是实现siRNA治疗的重要问题。一个合适理想的siRNA传递系统需要有以下几种特点：（1）载体系统应具有生物相容性、生物可降解性以及无免疫原性。（2）载体系统应可以保护siRNA不被核酸酶降解以及在体内不被清除（3）载体系统可以提高靶向性以及有着高的转染效率（4）当进入到靶细胞后，载体系统可以促进溶酶体逃逸，使siRNA尽快释放到细胞质中发挥沉默效率。因此安全性、稳定性、较高的转然效率以及靶向性是基因治疗的关键。

磷酸钙具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此磷酸钙纳米粒在生物医药领域有着非常广泛的应用。磷酸钙作为药物载体，磷酸钙纳米粒有着很多的优势。磷酸钙具有酸敏感性，在酸性内涵体或溶酶体酸性环境中，磷酸钙溶解，使得细胞内钙离子浓度明显增加，细胞内渗透压增加，促使纳米粒释放药物到细胞质中。但是，这样的传递系统一个缺点是在纳米粒制备后，磷酸钙晶体会快速增长容易沉淀，导致转染效率降低。因此制备纳米级的粒径合适以及稳定性良好的磷酸钙纳米粒具有非常重要的意义。Kataoka等用磷酸钙、基因以及PEG嵌段聚阴离子聚合物制备了一系列的纳米粒。中国专利申请（201310008569.8）授权了“聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法”。但是以上这些磷酸钙纳米粒都是通过EPR效应实现肿瘤的被动靶向。

于是我们尝试开发一种聚阴离子聚合物包裹磷酸钙纳米基因递送系统，该载体具有制备简单、方便、经济成本低并且具有二硫键敏感以及主动靶向的功能，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于开发一种聚阴离子聚合物包裹磷酸钙纳米基因递送系统，提高基因的释放、溶酶体逃逸功能以及靶向性，促进基因治疗的发展。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统，包括磷酸钙及交联透明质酸，其特征在于，磷酸钙包裹基因形成内核，巯基化透明质酸包覆于磷酸钙内核表面，透明质酸上面接枝的巯基至少部分氧化，例如在空气中静置，被空气氧化形成二硫键，从而形成交联透明质酸外壳包覆于内核表面，使磷酸钙纳米粒粒径变小、稳定性提高。其中所述透明质酸的分子量为10-150万，巯基取代度为20-90%，该纳米粒子的粒径为100~200nm。

优选地，所述巯基化透明质酸的分子量为30-70万，巯基取代度为30-60%。

聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米粒给药载体采用的技术方案是：

1）制备试剂A：CaCl2、缓冲盐溶液、基因；

2）制备试剂B：巯基化的透明质酸（HA-SH），磷酸氢二钠、氯化钠、缓冲盐水溶液；

3）将试剂A与试剂B混合；

4）所得纳米制剂静置一段时间，优选静置过夜；

其特征在于，

在所述试剂A中，缓冲盐溶液为缓冲盐为Hepes、Tris的一种或两种任意比例的组合；

在所述试剂B中，透明质酸的分子量为10-150万；巯基取代度为20-90%；缓冲盐为Hepes、Tris的一种或两种任意比例的组合。

优选地，试剂A中缓冲盐为Tris缓冲盐；试剂B中透明质酸分子量在30~70万，巯基取代度在30~60%；缓冲盐为Hepes缓冲盐。

优选地，基因与试剂A混合时的基因质量（μg）与试剂A的比例为60~100μg/mL。