[发明专利]利用鸡肉加工过程中的废弃器官-鸡头提取乙酰胆碱酯酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶的提取方法，具体涉及利用鸡肉加工过程中的废弃器官‐鸡头提取乙酰胆碱酯酶的方法。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是胆碱能神经传导过程中至关重要的一种酶，它能够快速水解神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)成乙酸和胆碱，从而终止ACh对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内正常传递。由于AChE对于ACh的高速水解作用，使得其近年来得到越来越多的研究人员的关注。AChE在生物防治、农药残留检测、分子生物学以及各种神经性疾病治疗方面有广泛的应用。最近研究表明，氨基甲酸乙酯在一定程度上可以抑制AChE的活性，因此AChE有可能应用在氨基甲酸乙酯(EC)的检测上。

AChE广泛存在于各种动植物组织中。目前，对于已经研究过的动物，主要集中在肝脏、血液和脑组织中，例如马血清，鲅鱼脑组织等。植物酯酶的研究尚未深入，有一些研究表明，粮食作物中酶活相对较高，但是对于大部分的粮食原料来说，乙酰胆碱酯酶的提取同时会造成粮食原料的浪费。由于酶源及制备工艺复杂等问题的存在，价格昂贵。因此需要探索原料丰富、成本较低及酶活较高的酶源，以利于推进AChE在各个方面的应用研究。而以鸡肉加工中的废弃器官及组织提取乙酰胆碱酯酶，可以达到对废弃物的综合利用，又可以实现原料的高值化。

发明内容

本发明提供利用鸡肉加工过程中的废弃器官‐鸡头提取乙酰胆碱酯酶的方法，所得产品可用于医药、葡萄酒和农残中有害成分氨基甲酸乙酯及其衍生物的检测等方面的应用研究。

本发明技术方案如下。

利用鸡肉加工过程中的废弃器官-鸡头提取乙酰胆碱酯酶的方法，包括以下步骤：

(1)乙酰胆碱酯酶的制备：

(1.1)将洗净烘干的表面皿称重，将新鲜的纵向斩开的鸡头用生理盐水冲 洗干净，用镊子将鸡脑取出至于表面皿中，去除非脑组织后再次称重；

(1.2)将鸡脑与含TritonX-100的磷酸盐缓冲液混合，得到混合液；

(1.3)将步骤(1.2)所得混合液用匀浆机匀浆1～5min后，静置10～60min，得到匀浆液；

(1.4)将匀浆液以3000～10000r/min，0～4℃离心10～30min，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；

(1.5)将步骤(1.4)所得的乙酰胆碱酯酶粗提液的上清液置于表面皿中，进行真空冷冻干燥，收集后即得乙酰胆碱酯酶制品；

(2)乙酰胆碱酯酶酶活的测定：

(2.1)取0.02～1.0mg的乙酰胆碱酯酶制品，用蒸馏水溶解后，得到酶液，在10mL的比色管内，加入1～5mL磷酸盐缓冲液，再加入0.01～0.1mL酶液混匀，于25～60℃恒温水浴锅中保温5～60min；

(2.2)向加入0.1～1.0mL碘化硫代乙酰胆碱溶液和0.1～1.0mL DTNB溶液后混匀；

(2.3)于400～500nm波长范围内用比色皿比色，记录吸光度，根据吸光度变化值来计算酶活和比活力,

式中：A—3min时吸光度的变化值；

V—反应体系总体积(L)；

ε—消光系数，1.36×10⁴L/(mol×cm)；

d—比色皿光程，1cm；

T—反应时间，3min。

上述方法中，用于提取乙酰胆碱酯酶的原料采用鸡脑这一废弃器官。

上述方法中，步骤(1)中所述的含TritonX-100的磷酸盐缓冲液中TritonX-100浓度为0.1％～3.0％(v/v)，所述比例为1：2～1：10(g/mL)；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02～0.2M，pH 7.0～9.0。

上述方法中，所述的进行真空冷冻干燥的液体厚度为0.1～2.0cm。

上述方法中，步骤(2.1)中所述的磷酸盐缓冲液pH 6.0～10.0，浓度为0.1M，所用恒温水浴锅温度在25～60℃，保温时间为5～60min。

上述方法中，所述的碘化硫代乙酰胆碱溶液浓度为5～30mg/mL。

上述方法中，所述波长范围在400～500nm。

本发明具有以下优点：

1、本发明所用酶源是鸡肉加工过程中的废弃器官-鸡脑及组织，原料丰富，成本较低，不仅可以达到对废弃物的综合利用，又可以实现原料的高值化。