[发明专利]抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种抗原结合单元稳定的嵌合型抗原受体，其中包含胞外的抗原结合单元、跨膜结构域、以及细胞内共刺激信号域，其中所述抗原结合单元相对于肿瘤特异性靶点表达稳定，所述抗原结合单元包含通过由SEQ ID NO.2氨基酸序列编码的铰链相连接的重链以及轻链，本发明还涉及表达该受体的细胞及其应用。

技术领域

本发明涉及含有高稳定性的抗原结合单元的嵌合抗原受体，及其制备方法，含有所述人工嵌合抗原受体的细胞，以及其应用。

背景技术

过继免疫治疗采用的是未经基因修改的T细胞，并且已经在治疗某些癌症以及病毒感染上展示其潜在的能力。例如通过供体淋巴输入(DLI)引发的移植物抗白血病效应(GVL)用于复发性白血病的治疗以及通过注射体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)结合治疗前淋巴细胞消除用于治疗晚期黑色素瘤。然后无论是DLI还是TIL治疗都具有严重的副作用以及没有特异性而限制了其功效。现今已经尝试发现有效的免疫原性抗原用于对效应T细胞的修改，其可以有选择性的针对白血病或者其他肿瘤。

T细胞过继免疫治疗是指将自体或者异体肿瘤激活的T细胞进行体外分离并且扩增用于治疗肿瘤病人。它对于治疗转移性黑色素瘤具有卓越的成效，并且该反应以及在50％的病人身上得到了客观的验证。

含有肿瘤特异性受体的肿瘤浸润淋巴细胞是来源于一些肿瘤病人的，而过继T细胞治疗则通过引入循环淋巴细胞抗原而得到发展。为了做到这一天，基因编码的T细胞受体可以来源于活动性高，肿瘤特异性T细胞或者来源于嵌合型抗原受体，它们包含了类似于抗体的外部结构和细胞内T细胞信号域，例如CD3ζ，而这些可通过逆转录病毒以及慢病毒进行引入。因为嵌合型抗原受体T细胞其对肿瘤细胞的攻击是不受MHC限制的，因此他扩大了T细胞过继免疫治疗的应用。目前，多种CART相关的，用于淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，黑色素瘤以及成神经细胞瘤的临床治疗研究正在进行中。

B细胞淋巴瘤患者是一个很大的群体，其中慢性淋巴细胞白血病患者会死于这个疾病。而其中一个能够治疗这些病人的方法就是通过基因改造将能够针对肿瘤细胞上特异性表达的抗原的嵌合型抗原受体表达在T细胞上。嵌合型抗原受体(CAR)是一种设计出来不依赖于人类白细胞抗原并且可识别细胞膜表面抗原的抗原受体。人们正在尝试利用这种表达CAR的基因改造的T细胞用于治疗一些类型的病人(Brentjens et al.,2010,MolecularTherapy,18:4,666-668；Morgan et al.,2010,Molecular Therapy,published onlineFeb.23,2010,pages 1-9；and,Till et al.,2008,Blood,112:2261-2271)。

在许多肿瘤中，肿瘤特异性抗原并没有被发现，但在B细胞淋巴瘤中，CD19是一个非常有潜力的肿瘤抗原。CD19仅表达于正常B细胞以及B细胞淋巴瘤上，所以CD19是被广泛接受并且可以安全用于CART的抗原。虽然CARs触发T细胞激活的方式与内源性T细胞受体激活的方式类似，但该技术用于临床应用的主要障碍是CART细胞在体内的扩增，以及其注射后细胞的迅速消失和令人失望的临床活动(Jena,et al.,Blood,2010,116:1035-1044；Uckun,et al.Blood,1988,71:13-29)。

在许多肿瘤中，肿瘤特异性抗原并没有被发现，但在B细胞淋巴瘤中，得力于淋巴细胞消除的发展CART的临床结果也得到了提高，通过抗CD19的嵌合型抗原受体T细胞在B细胞淋巴瘤的应用证明了以基因改造T细胞为基础的过继免疫治疗其在临床抗肿瘤的许多问题得到了解决。但是，在这个治疗方案被广泛接受之前还是有许多没有解决的问题。其中的一个问题就是单链可变区片段(scFv)作为一个融合蛋白在细胞膜表面表达的稳定性。正如大家所知道的scFv作为抗体的单元是不稳定的，以及在早前研究中也发现CAR的胞外部分的稳定性会影响T细胞的功能(gene Therapy,6,412)。由于CAR在肿瘤治疗使用中其组分以及方法的稳定性将影响其功能，因对于其组分稳定性的研究以及方法的建立是迫切需要的。本发明恰好解决了这一需要。