[发明专利]马红球菌致病基因VapA重组蛋白的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及马红球菌致病基因VapA蛋白的应用。

背景技术

马红球菌属于红球菌属，是一种人畜共患的条件性致病菌。该病原菌普遍存在于自然环境土壤中，调查表明，50～95％的农场土壤中存在该菌。马红球菌可感染人，导致呼吸道感染症状。该病也是幼龄马驹最常见的疾病之一，发病率可达80％。染病马驹一般呈慢性或亚急性支气管肺炎症状，有时伴发盲结肠和肠系膜淋巴结溃疡。

一直以来关于马红球菌的致病机制并不清楚，直至最近研究发现，导致该细菌毒性的关键是其是否含有一个致病性相关质粒。该质粒含有85～90kb的遗传编码DNA，可编码多个高免疫原性的毒性脂蛋白。其中，毒性相关蛋白A(Vap A)为其主要表达蛋白。大量研究表明，马红球菌的毒性与Vap A密切相关。目前，虽有部分重组VapA蛋白表达的报道，但其表达的蛋白多以包涵体的形式存在，较难应用于实际的医疗诊断和治疗产品的开发和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供马红球菌致病基因VapA蛋白的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备治疗由马红球菌引起的疾病的制剂中的应用，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

申请人通过研究发现，MBP-VapA蛋白更接近马红球菌致病基因VapA的性质，因此MBP-VapA蛋白在中和抗马红球菌抗体时具有很高的活性。

因此，本发明还提供了马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备检测由马红球菌引起的疾病的制剂中的应用，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种制备治疗马红球菌病的免疫血清的方法，包括以下步骤：

S1.MBP-VapA重组蛋白的制备：扩增VapA基因，并克隆到PMAL-C5x载体上，构建表达载体PMAL-VapA，将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导获得MBP-VapA重组蛋白；

S2.将纯化后的MBP-VapA重组蛋白与免疫佐剂混合后免疫动物，获得免疫血清。

本发明使用PMAL-C5x载体，它可以促进重组表达蛋白的可溶性表达，实验研究表明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质三级、四级拓扑结构的形成，进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本研究首次采用PMAL-C5x为载体，对马红球菌的致病基因VapA进行了重组，获得重组质粒—PMAL-VapA。

另外，发明人通过实验发现，单单使用PMAL-C5x载体，对VapA蛋白的可溶性表达虽然有促进作用，但作用并不明显，还必须要配合低温诱导的温度，才能够使VapA蛋白大量可溶性表达，发明人研究了多个诱导温度对VapA蛋白的表达影响，结果显示，只有在20℃时才能够获得大量的可溶性的VapA蛋白，该VapA蛋白带有MBP标签。

本发明通过上述方法获得了大量可溶性表达且活性好的VapA蛋白，该蛋白具有良好的免疫原性。

优选的，所述本发明所述免疫动物可以是兔子或小鼠，免疫血清可以是兔抗马血清，也可以是鼠抗马血清。

更优选地，本发明所述免疫动物为兔子，免疫血清是兔抗马血清。

发明人将纯化后获得的MBP-VapA蛋白进行ELISA检测，结果表明纯化的MBP-VapA可用于R.equi特异性抗体的检测。

优选地，本发明所述原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.5～0.7后，加入IPTG进行诱导；更优选地，原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.6后加入IPTG进行诱导。

优选的，本发明所述IPTG诱导的浓度为0.3～0.7mM，诱导时间为8～12h。

更优选地，申请人发现所述原核表达菌在20℃培养下，IPTG诱导浓度为0.7mM，且诱导时间为8h时，VapA蛋白的表达量最高，且多为可溶性表达。

具体地，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白通过以下方法获得：