[发明专利]一种检测马红球菌病的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种检测马红球菌病的试剂盒。

背景技术

马红球菌属于红球菌属，是一种人畜共患的条件性致病菌。该病原菌普遍存在于自然环境土壤中，调查表明，50～95%的农场土壤中存在该菌。马红球菌可感染人，导致呼吸道感染症状。该病也是幼龄马驹最常见的疾病之一，发病率可达80%。染病马驹一般呈慢性或亚急性支气管肺炎症状，有时伴发盲结肠和肠系膜淋巴结溃疡。

一直以来关于马红球菌的致病机制并不清楚，直至最近研究发现，导致该细菌毒性的关键是其是否含有一个致病性相关质粒。该质粒含有85～90kb的遗传编码DNA，可编码多个高免疫原性的毒性脂蛋白。其中，毒性相关蛋白A（Vap A）为其主要表达蛋白。大量研究表明，马红球菌的毒性与Vap A密切相关。目前，虽有部分重组VapA蛋白表达的报道，但其表达的蛋白多以包涵体的形式存在，较难应用于实际的医疗诊断和治疗产品的开发和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供马红球菌致病基因VapA蛋白的试剂盒和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种检测马红球菌病的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括作为免疫原的马红球菌致病基因VapA重组蛋白MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述试剂盒还包括适于MBP-VapA与抗马红球菌致病基因VapA抗体发生抗原抗体反应的检测试剂。

具体地，所述试剂盒还可以包括包被有MBP-VapA的固相载体、酶标抗体。

另外，本发明所述试剂盒还包括封闭液、洗涤液、显色液、终止液、阳性和阴性对照。

其中，所述阴性对照为胎马血清，阳性对照为马红球菌灭活疫苗免疫的成年马血清，酶标抗体为羊抗马IgG Fab'2-HRP。

本发明通过优化实验，获得最佳的ELISA试剂盒的参数：MBP-VapA的包被浓度为0.125ug/mL，阴性对照和阳性对照血清稀释度为1：400，羊抗马 IgG Fab'2-HRP稀释度为1：20000，封闭液为0.5%PVA。

本发明还提供一种检测马红球菌病的ELISA试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S1. 免疫原的制备如下：扩增VapA基因，并克隆到PMAL-C5x载体上，构建表达载体PMAL-VapA，将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导、纯化后获得重组蛋白MBP-VapA；

S2. 分别配制酶标抗体羊抗马IgG Fab'2-HRP、阴性对照胎马血清、阳性对照马红球菌灭活疫苗免疫的成年马血清和封闭液PVA获得ELISA试剂盒。

马红球菌致病基因VapA蛋白是重要的毒性蛋白，现有技术中关于该蛋白研究较少。一般纯化出的马红球菌致病基因VapA蛋白多以包涵体的形式存在，从而限制了其实际应用。申请人通过大量探索发现：将VapA基因与PMAL-C5x载体相连，并配合20℃的诱导温度可以表达出大量可溶性表达的VapA蛋白。

本发明使用PMAL-C5x载体，它可以促进重组表达蛋白的可溶性表达，实验研究表明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质三级、四级拓扑结构的形成，进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本研究首次采用PMAL-C5x为载体，对马红球菌的致病基因VapA进行了重组，获得重组质粒—PMAL-VapA。

另外，发明人通过实验发现，单单使用PMAL-C5x载体，对VapA蛋白的可溶性表达虽然有促进作用，但作用并不明显，还必须要配合低温诱导，才能够使VapA蛋白大量可溶性表达。发明人研究了多个诱导温度对VapA蛋白的表达影响，结果显示，只有在20℃时才能够获得大量的可溶性的VapA蛋白。

本发明通过上述方法获得了大量可溶性表达且活性好的VapA蛋白，该蛋白具有良好的免疫原性，本发明所得到的MBP-VapA更接近马红球菌致病基因VapA的性质。

优选地，MBP-VapA的制备方法中，所述原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.5～0.7后，加入IPTG进行诱导；更优选的，原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.6后加入IPTG进行诱导。

优选的，本发明所述IPTG诱导的浓度为0.3～0.7mM，诱导时间为8～12h。