[发明专利]一种应用于大肠杆菌的培养基及培养方法

说明书

技术领域

   本发明涉及生物技术领域，具体是指一种应用于大肠杆菌的培养基及培养方法、大肠杆菌种子液的制备方法。

背景技术

大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠埃希菌”，属于肠道杆菌大类中的一种。它是寄生在人体大肠里对人体无害的一种单细胞生物，结构简单，繁殖迅速，培养容易，它是生物学上重要的实验材料。

正常情况下，大多数大肠杆菌是非常安分守己的，不但不会给我们的身体健康带来任何危害，反而还能竞争性抵御致病菌的进攻，同时还能帮助合成维生素K2，与人体是互利共生的关系。只有在机体免疫力降低、肠道长期缺乏刺激等特殊情况下，才会兴风作浪，移居到肠道以外的地方，例如胆囊、尿道、膀胱、阑尾等地，造成相应部位的感染或全身播散性感染。因此，大部分大肠杆菌通常被看作机会致病菌。

各种动物大肠杆菌灭活疫苗的制备中，首要环节就是大肠杆菌的培养。为了获得理想的活菌浓度，业界对大肠杆菌培养工艺进行了大量研究。影响大肠杆菌培养菌浓度的因素有很多，如培养基组成、培养时间、菌种接种量以及细菌生长环境等。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种应用于大肠杆菌的培养基及其培养方法、大肠杆菌种子液制备方法，培养工艺简单，获得理想的高活菌浓度。

本发明通过下述技术方案实现如下：一种应用于大肠杆菌的培养基及其培养方法，由下列物质组成：蛋白胨15.0g、酵母膏粉3.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖0.2g、十二烷基硫酸钠0.1g、琼脂12.0g、混合显色底物6.77g、蒸馏水100ml、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液4ml、链霉素溶液0.66ml、孟加拉红溶液0.33ml、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.05g。。

进一步地，为更好的实现本发明，所述链霉素溶液浓度为10000u/ml。

进一步地，为更好的实现本发明，所述培养基pH为7.2～7.4。

一种大肠杆菌种子液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

（1）称量，按培养基的配方比例依次准确称取蛋白胨、酵母膏粉、氯化钠、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、混合显色底物、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液、链霉素溶液、孟加拉红溶液、KH₂PO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O 放入烧杯中；

（2）溶化，在上述烧杯中加入适量蒸馏水、搅拌，加热溶解，按配方比例称取琼脂，加热溶化；

（3）调节PH；

（4）分装 将培养基分装入三个试管和三角烧瓶中，试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2，分装完后，加塞；

 （5）包扎 加塞后，用麻绳将试管捆绑，在棉塞外包一层牛皮纸，作好记录；

 （6）灭菌  将上述培养基以0.1MPa，121℃，25min高压蒸汽灭菌；

 （7）倒平板 取已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒置三个平板培养基，冷却；

（8）搁置斜面，取灭菌的试管培养基冷却至50℃，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置斜面长度不超过试管总长的一半；

 （9）取制备的大肠杆菌种子，用接种环在已制备的的斜面上接种大肠杆菌；

（10）所述步骤（9）接种好的斜面放入37℃的恒温箱培养箱子中培养24小时；

（11）在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用无菌生理盐水将菌种进行冲洗，再用无菌生理盐水将其按梯度进行稀释，分别吸取溶液土布平板，然后再37℃培养箱中过夜；

（12）选择生长状态好、特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的大肠杆菌培养基中37℃170r/min恒温培养18小时作大肠杆菌种子培养液。

一种培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）一级种子的制备，大肠杆菌菌种分别接种于含0.1%微量盐溶液的培养基中，37℃条件下培养24小时，划线接种琼脂平板上培养，再接种马丁琼脂斜面，37℃条件下培养20～24小时，作为一级种子；

（2）二级种子的制备，将大肠杆菌菌株的一级种子液接种到培养基中，37℃条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置3～7℃条件下保存；

（3）将大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1%微量盐溶液的培养基，二级种子液接种量为培养基体积总量的2～3%，菌株种子在37℃条件下于微生物摇床内培养11～13小时。