[发明专利]将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法。

背景技术

近十年糖尿病的发病率日益上升,正越来越严重的危害人类健康。但传统的治疗方法却未能有效而稳定地控制血糖,因此研究者试图改进糖尿病的治疗方法,转而将目光投向胰岛细胞移植。但是这一疗法却因细胞来源匾乏而受到限制。面对细胞来源的巨大缺口,目前最有希望的就是从脂肪间充质干细胞诱导分化出大量可供移植的胰岛样细胞。己经有研究报道,多种成体干细胞都可以被诱导分化为胰岛β样细胞。

传统的糖尿病治疗包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗等几个方面，该类方法均能达到长期有用的效果。细胞疗法治疗糖尿病是从细胞水平进行修复、补充受损细胞，其效果是其他疗法所不能比拟的。这种治疗用的诱导细胞在体内微环境下具有再分化能力，能够分化出新的细胞及组织，达到不可比拟的医学价值。

研究表明脂肪间充质干细胞便于获取，体外增殖能力强。其生物学特性与脐带间充质干细胞相似，并可向神经，胰岛，肝，脂肪等多种细胞转化。由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便，创伤小等特点。在组织工程、基因治疗、器官修复等方面都有着广阔的运用前景。

发明内容

本发明的目的是：提供一种将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法，它安全无毒，诱导成功率高。

本发明是这样实现的：将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基，包括DMEM培养基，其中激活素为3mmol/L，反式维甲酸为1umol/L，EGF为100ng/ml，bFGF为10ng/ml ，胰高血糖素样肽1为10ng/ml，尼克酰胺为10mmol/L。

将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，将脂肪组织消化后，进行原代细胞培养及传代培养；将传3代的脂肪间充质干细胞，采用质量百分比为0.25% Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度至1 X 10⁴/cm²，接种于24孔板内，制备细胞爬片；待细胞达到75%-85融合后，生长旺盛时用上述培养基进行诱导分化，诱导时间为7天，将诱导后的细胞进行鉴定。

所述的细胞鉴定方法为双硫腙染色反应，流式细胞术检测胰岛阳性细胞。

反式维甲酸在体内对中，外胚层的发育起重要的作用，一般常用于体外向神经细胞分化的实验中。最近有研究表明,反式维甲酸也参与内胚层的组织细胞分化，它在早期胚胎胰腺发育过程中是一个重要的信号分子。

激活素A是转化生长因子(Transforminggrowthfactor,TGF)β家族成员，其受体在胚胎和成体胰岛的a和δ细胞中表达；它对细胞的增殖、分化、凋亡都起着重要作用。

EGF可以促进有丝分裂活性，对一多种表皮细胞和上皮细胞，甚至是祖细胞的生长有刺激作用；参与损伤的修复。

GLP-1(胰高血糖素样肽1)可以剌激胰岛细胞增殖、分化，抑制胰岛细胞凋亡；而且可以促进胰岛素基因转录，促进细胞分泌胰岛素。

为了验证本发明的技术效果，申请人进行了如下实验：

1.Ⅰ糖尿病小鼠模型的制作

l)实验动物:雄性小鼠(sPF级),鼠龄8一12周,体重18一22克;

参与实验的小鼠共35只,随机分为2组,其中正常小鼠组为5只,参与模型制作的小鼠为30只;

2)用天平称量小鼠体重,并取尾血,用血糖仪测小鼠基础血糖值;

3)参与造模的小鼠予以禁食12h;

4)将链脉霉素（STZ）充分溶解于新鲜配制的0.lmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.6)中,配制成质量分数为1%的STZ溶液;

5)按180mg/kg体重的剂量,予小鼠腹腔注射1%的STz溶液;

6)造模后第3d,第6d取尾血,用血糖检测仪检测小鼠血糖水平,均出现高血糖(非禁食血糖大于16.7mmol/L)者脚]认为造模成功,入选实验;

7)造模成功的糖尿病小鼠再随机分为3组,分别为细胞因子组(5只)(移植经诱导的细胞)脂肪干细胞组(5只)(移植未经诱导的细胞)单纯STZ造模组(5只)正常组(5只）即本实验分组情况如下:细胞因子组(5只)、脂肪干细胞组(5只)、单纯STZ造模组(5只)、正常组(5只)。

2.  Ⅰ型糖尿病小鼠模型的制备情况