[发明专利]人胚肾细胞HEK293T电转染的方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因技术领域，尤其涉及一种人胚肾细胞HEK293T电转染的方法。

背景技术

人胚肾细胞HEK293T是一个常用的研究表达外源基因的细胞株，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染。HEK293T细胞由293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，因其较高的转染效率而被广泛应用于瞬时转染，过表达各种目标蛋白,或是用以包装病毒。

HEK293T细胞常采用脂质体转染方法，操作周期通常为两天，但是，脂质体试剂本身颇为昂贵，且带有毒性，影响细胞的正常生长。病毒转染是另一种常用的HEK293T细胞的转染方法，其制备周期更长，通常为1-2个月，且价格不菲，因改造后病毒仍然具有侵染性，操作起来颇为繁琐。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简便、周期较短的人胚肾细胞HEK293T电转染的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，采用低渗透压的电转染缓冲液，对人胚肾细胞HEK293T进行一次放电；电转染缓冲液的渗透压为90～280mOsmol/kg，一次放电的电压为130～810V，持续时间为45～75μs(微秒)。

电转染缓冲液的渗透压为200～280mOsmol/kg。

一次放电的电压为100～200V或200～300V或300～400V或400～600V，持续时间为75μs。

电转染缓冲液的渗透压为250mOsmol/kg，一次放电的电压为130V或260V或390V或520V，持续时间为75μs。

电转染缓冲液由低渗透压溶液和等渗透压溶液配制而成；低渗透压溶液组成为KCl25mM、KH₂PO₄0.3mM、KHPO 0.85mM、肌醇90mOsmol/kg，pH7.1～7.3,电导率，25度3.2～3.8mS/cm)；等渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH₂PO₄ 0.3mM、K₂HPO₄ 0.85mM、肌醇280mOsmol/kg，pH7.1～7.3，电导率，25度3.2～3.8mS/cm。

电转染是一种备受关注的转基因方法，其成本低廉，只需要普通缓冲盐溶液即可，周期短，通常只需一天，操作简便，不会对细胞产生强大的毒副作用。针对脂质体转染和病毒转染的周期长、成本高、操作繁琐的问题，发明人结合电转染的上述优点，建立了一种人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，该法主要采用低渗透压的电转染缓冲液，对人胚肾细胞HEK293T进行一次放电，通过高压脉冲电场和低渗透压组合，使得细胞体积增大，脉冲电场更容易击穿细胞膜，增加膜穿孔数量，外源分子更容易进入细胞质中，从而提高电转效率。实际测试表明，应用本发明HEK293T细胞转染pmaxGFP(绿色荧光蛋白)细胞学实验结果转染效率达到60％左右。本发明可以缩短周期，降低成本，减少操作复杂性，为HEK293T细胞系转基因研究提供关键的技术支持。

附图说明

图1是传统脂质体转染HEK293T细胞的荧光显微镜图。

图2是传统脂质体转染HEK293T细胞不加质粒的阴性对照的荧光显微镜图。

图3是本发明电转染(130V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。

图4是本发明电转染(260V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。

图5是本发明电转染(390V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。

图6是本发明电转染(520V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。

图7是各种不同条件下转染进gfp的细胞占总细胞的比例的柱状图。

具体实施方式

采用脂质体转染和本发明电转染方法的转染率进行对比，同时设置不转质粒的组作为阴性对照。

一、人胚肾细胞HEK293T电转染的方法

试验方法：用人胚肾细胞HEK293T通过本发明电转染方法转染AMAXA公司的货号为VPA1001的pmaxGFP(绿色荧光蛋白)质粒，采用荧光显微镜拍照计算发绿色荧光数目的细胞以分析转染效率。试验中包括了对细胞实施四种不同电压，相同渗透压的缓冲液以及相同脉冲时长的放电时间。

试验设备：型号eppendorf multiporator，货号4308CG831520。