[发明专利]一株重组大肠杆菌的构建及其合成(S)-2-羟基-3-苯基丙酸的方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物技术领域，特别涉及一株重组大肠杆菌的构建及其合成 (S)-2-羟基-3-苯基丙酸的方法。

背景技术

苯乳酸(phenyl lactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，3-苯基乳酸或β-苯乳酸。PLA为淡黄色粉末，略有特殊性气味，分子式为C₉H₉O₃，相对分子量为166，熔点121~125 ℃，对酸和热稳定。PLA是近年来发现的一种新型天然防腐剂，广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中，是由多种微生物(主要是乳酸菌)中苯丙氨酸的代谢产物。这种由公认为安全的乳酸菌代谢产生的芳香族有机酸经研究表明对人和动物细胞无毒。PLA是继乳酸菌产生的第一代抑菌物质如乳酸、醋酸和第二代抑菌物质如乳酸链球菌素(nisin)、片球菌素(pedioein)等细菌素以外的第三代天然小分子抑菌物质。与多数天然防腐剂相比，苯乳酸抑菌谱更广，能抑制多种食源性致病菌、腐败菌，特别是能抑制真菌污染，是使乳酸菌发酵产物抗真菌性强和较长货架期的主要活性物质之一；溶解性好，易于在食品体系中扩散；稳定性高，具有宽广的pH范围和热稳定性，这些优点利于其在食品工业具有广阔的应用前景。

PLA第二个碳原子为手性碳原子，因此有(S)-2-羟基-3-苯基丙酸，即L-PLA和(R)-2-羟基-3-苯基丙酸，即D-PLA两种对映异构体，而两种异构体对生物体的作用及其在医药、化工方面的应用有显著差异，因此获得光学纯度高的单一对映体PLA是其在食品和医药领域广泛应用的前提。

前期研究发现一些芽孢杆菌属细菌如Bacillus megaterium Z2013513 (CCTCC NO:M2013244)具有较乳酸菌相比更强的PLA合成能力，并且因其营养要求低、生长迅速、安全性好而具有良好的开发潜力。但由于芽孢杆菌属特有的芽孢形成和同类相食效应，抑制了PLA合成能力的进一步提高，且只能催化产生D-PLA，但不能产生L-PLA。如果能够进一步提高微生物合成L-PLA生产效率及高密度细胞生物合成L-PLA将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种L-乳酸脱氢酶基因，解决目前芽孢杆菌属细菌合成PLA生产效率较低，只能催化产生D-PLA，但不能产生L-PLA的问题。

本发明的第二目的是提供携带上述的L-乳酸脱氢酶基因的重组表达质粒。

本发明的第三目的是提供含有上述重组质粒的重组大肠杆菌。

本发明的第四目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。

本发明的第五目的是提供上述重组大肠杆菌的用途。

本发明的第六目的是提供上述重组大肠杆菌转化苯丙酮酸合成L-苯基乳酸的方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种L-乳酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

二、携带上述的L-乳酸脱氢酶基因的重组表达质粒pET-28a-ldhL。

三、含有上述的载体的重组大肠杆菌。

四、上述的重组大肠杆菌的构建方法，该方法包括以下步骤：

（1）根据大肠杆菌的密码子偏好性对巨大芽孢杆菌（Bacillus megateriumZ2013513）CCTCC NO：M 2013244 L-乳酸脱氢酶基因进行密码子优化；

（2）将密码子优化的L-乳酸脱氢酶基因导入pET-28a(+)载体得到重组表达载体pET-28a-ldhL；

（3）将得到的重组表达载体pET-28a-ldhL转化E. coli BL21(DE3)后得到重组大肠杆菌。

五、上述的重组大肠杆菌在转化苯丙酮酸合成(S)-2-羟基-3-苯基丙酸中的应用。

六、上述的重组大肠杆菌转化苯丙酮酸合成(S)-2-羟基-3-苯基丙酸的方法，该方法包括以下步骤：

（1）全细胞菌悬液制备，将重组大肠杆菌单菌落接种至种子培养基中活化，再将此种子液接种至扩大培养基中培养至对数中期，添加产酶诱导剂IPTG，低温诱导并收集菌体以获得全细胞菌悬液；

（2）流加底物苯丙酮酸和葡萄糖，全细胞生物转化合成(S)-2-羟基-3-苯基丙酸。