[发明专利]一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法

权利要求书

1.一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）采用Trizol试剂抽提家蚕头部总RNA；用RT-PCR试剂盒以家蚕头部总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，在M-MuLV反转录酶的作用下反转录合成cDNA第一链；以第一链cDNA为模板通过PCR扩增家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace，将bmace基因连入PMD-18-T载体，连接产物转化转化大肠杆菌DH5α；以重组质粒PMD-18-T-bmace为模板PCR扩增带MluⅠ酶切位点的bmace基因，并在5′端引入6×His标签；

2）使用酵母基因组抽提试剂盒提取酿酒酵母INVSc1基因组DNA，以此为模板通过PCR扩增锚定蛋白基因AGα1，同时在扩增片段的5′端引入一段linker序列；

3）通过PCR将步骤1）中的bmace基因与步骤2）中的锚定蛋白基因AGα1预拼接在一起，通过重叠延伸PCR扩增融合基因bmace-AGα1；

4）将酵母表达载体pPIC9K和步骤中的融合基因bmace-AGα1同时做双酶切，酶切过后将二者连接在一起构成重组质粒pPIC9K-bmace-AGα1，连接产物转化大肠杆菌DH5α；经过PCR鉴定和酶切鉴定正确后将重组载体pPIC9K-bmace-AGα1转化毕赤酵母GS115形成转化子GS115/pPIC9K-bmace-AGα1，筛选阳性重组子，并利用甲醇对阳性重组子进行诱导表达，表达结束后离心去除上清液，将菌体冷冻干燥即得重组家蚕乙酰胆碱酯酶；

所述PCR扩增的引物如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.14所示。

2.根据权利要求1所述方法制备得到的重组家蚕乙酰胆碱酯酶。

3.根据权利要求2所述重组家蚕乙酰胆碱酯酶在检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留中的应用。

4.一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶制剂，其特征在于，包括权利要求2所述的重组家蚕乙酰胆碱酯酶、辅助试剂A、辅助试剂B和辅助试剂C；其中，所述辅助试剂A为乙酸-α-萘酯，辅助试剂B为固蓝B盐，辅助试剂C为pH 7.5的磷酸盐缓冲液粉剂。

5.根据权利要求4所述的酶制剂，其特征在于，所述辅助试剂A使用时溶于丙酮中，配成浓度为0.03 mol/L的溶液。

6.根据权利要求4所述的酶制剂，其特征在于，所述辅助试剂B使用时溶于甲醇中，配成浓度为0.06 mol/L的溶液。

7.根据权利要求4所述的酶制剂，其特征在于，所述辅助试剂C使用时的浓度为50mM。

8.一种检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法，其特征在于，将权利要求4所述的重组家蚕乙酰胆碱酯酶与辅助试剂C混匀后得液体酶制剂，将待测样品和适量液体酶制剂混合，2～3分钟后加入权利要求4所述的辅助试剂A和辅助试剂B，1～2分钟后观察待测液的颜色，如果出现紫红色，则说明农药残留未超标，如果出现浅红色或黄色，则说明农药残留超标；另外，将检测结果与标准比色卡作比较，则可粗略知道农药的残留量。