[发明专利]一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及农药残留快速检测技术领域，具体地，涉及一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法，更具体地，涉及一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法。

背景技术

农药的使用在给农业生产带来巨大经济效益的同时，也对环境与产品造成严重的污染，给人民身心健康带来很大的影响。目前农药残留检测的方法主要有仪器分析法，免疫分析法和酶抑制法等。仪器分析法检测灵敏度高、选择性好、定性定量可同时进行、结果准确可靠，是目前检测农药残留的标准方法和仲裁方法，但仪器法需要使用实验室昂贵的大型分析仪器，依靠专业技术人员完成分析工作，而且样品前处理操作繁琐、时间较长，因而只能应用于实验室，很难适应现场简单快速和大量样品农药残留分析的要求，不利于在基层进行推广应用。免疫分析法具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，但该方法对试剂的选择性高，容易受到检测样品基质的影响，对结构类似的化合物也有一定的交叉反应，且具有多残留识别的宽谱特异性抗体的制备尚在研究阶段。当前我国农药残留快速检测技术中酶抑制法的发展时间比较长，较其他速测方法更为成熟，操作更加简单，成本更低，具有快速、灵敏、准确的优点，能有效弥补仪器分析方法前处理繁琐、检测费用高，难以满足高通量、快速和在线检测等方面的不足，更适合我国的国情，能够作为仪器分析方法的有益补充。但是，市售的农药残留快速检测试剂盒或试纸条其核心材料胆碱酯酶多是直接从家蝇、马血清、鱼肉组织、猪肝、羊血红细胞、植物组织等提取得到的，这些从生物体中直接分离提取的胆碱酯酶存在提取量低、纯化困难、种类间灵敏度差异大、稳定性差等不足，因此在实际检测中极易出现假阳性，应用中缺点较多。王栋等将家蝇乙酰胆碱酯酶基因分别构建到原核和真核表达系统中，分别进行原核和真核表达，但是，结果发现原核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶活力很低，而真核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶没有活性。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法。通过该方法制备得到的重组家蚕乙酰胆碱酯酶产量大、灵敏度高且稳定，而且可在家庭、市场、蔬菜生产基地等现场进行快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留。

本发明的另一个目的是提供一种检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶制剂。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法，包括以下步骤：将家蚕乙酰胆碱酯酶基因与锚定蛋白基因AGα1相连插入到酵母表达载体pPIC9K中构建成表面展示载体并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性重组子，并利用甲醇对阳性重组子进行诱导表达，表达结束后离心去除上清液，将菌体冷冻干燥即得重组家蚕乙酰胆碱酯酶。

现有技术中也有人采用重组表达技术来制备重组乙酰胆碱酯酶，如王栋等将家蝇乙酰胆碱酯酶基因分别构建到原核和真核表达系统中，分别进行原核和真核表达，但是，结果发现原核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶活力很低，而真核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶没有活性。本发明将家蚕乙酰胆碱酯酶基因与锚定蛋白基因AGα1相连构建到表面展示载体中并转化毕赤酵母，通过固定化展示技术得到的重组酶的活性很好。

优选地，所述家蚕乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

由如上方法制备得到的重组家蚕乙酰胆碱酯酶。

如上方法制备得到的重组家蚕乙酰胆碱酯酶在检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留中的应用。

一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶制剂，包括如上所述的重组家蚕乙酰胆碱酯酶、辅助试剂A、辅助试剂B和辅助试剂C；其中，所述辅助试剂A为乙酸-α-萘酯，辅助试剂B为固蓝B盐，辅助试剂C为pH 7.5的磷酸盐缓冲液粉剂。

优选地，所述辅助试剂A使用时溶于丙酮中，配成浓度为0.03 mol/L的溶液。

优选地，所述辅助试剂B使用时溶于甲醇中，配成浓度为0.06 mol/L的溶液。

优选地，所述辅助试剂C使用时的浓度为50mM。

辅助试剂A的制备：将酯类物质乙酸-α-萘酯溶于有机溶剂，有机溶剂为丙酮，搅拌均匀使其浓度为0.03 mol/L，溶液于4℃可保存一个月。

辅助试剂B的制备：将显色剂固蓝B盐溶于有机溶剂，有机溶剂为甲醇，搅拌均匀使其浓度为0.06 mol/L，稳定性比其水溶液好。