[发明专利]用于樱桃病毒检测的多重RT‑PCR试剂盒及检测方法

权利要求书

1.用于检测樱桃病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的如下的四对引物：

CVA-F：5’-TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3’，

CVA-R：5’-TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3’；

ACLSV-F：5’-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3’，

ACLSV-R：5’-GTCTACAGGCTATTTATTATAAG-3’；

CGRMV-F：5’-AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3’，

CGRMV-R：5’-GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3’；

LChV-1F：5’-GGTTGTCCTCGGTTGATTAC-3’，

LChV-1R：5’-GGCTTGGTTCCATACACTTC-3’；

所述樱桃病毒为CVA，ACLSV，CGRMV和/或LChV-1；

所述四对引物的摩尔比为CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1＝1：11.25：0.5：10。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下：

nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，

nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述五对引物的摩尔比为：

CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1：nad5＝1：11.25：0.5：10：1.125。

4.用于检测樱桃病毒的mRT-PCR方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA模板；

(2)采用权利要求1所述的试剂盒中的四对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR反应，得到扩增产物；

(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现1184bp大小的条带，则样品中含有CVA；若扩增产物中出现791bp大小的条带，则样品中含有ACLSV；若扩增产物中出现468bp大小的条带，则样品中含有CGRMV；若扩增产物中出现300bp大小的条带，则样品中含有LChV-1。

5.根据权利要求4所述的方法，所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CVA-F/R 0.08μM，ACLSV-F/R 0.9μM，CGRMV-F/R 0.04μM，LChV-1F/R 0.8μM。

6.根据权利要求5所述的方法，所述PCR反应的退火温度为55℃。

7.根据权利要求6所述的方法，所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，循环35次；最后72℃延伸10min。