[发明专利]用于樱桃病毒检测的多重RT‑PCR试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及用于樱桃病毒检测的多重RT-PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

由于栽培樱桃有较高经济效益，近几年樱桃的栽培在我国各地发展较快。我国的大樱桃栽培主要集中在山东的烟台，辽宁的大连，河北的秦皇岛等地，目前北京、山西、江苏、安徽、河南、甘肃、新疆等地均有栽培种植。但近年来，病毒病呈日益加重的趋势，成为影响樱桃产量和品质的重要因素。据国外报道，侵染大樱桃的病毒约有30多种，比较常见的大樱桃病毒主要有20种。我国已报道的侵染樱桃的主要病毒有：李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV)，李矮缩病毒(Prune dwarf virus，PDV)，樱桃病毒A(Cherry virus A，CVA)，樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus，CGRMV)，樱桃小果病毒－2(Little cherry virus-2，LChV-2)，樱桃小果病毒-1(Little cherry virus-1，LChV-1)，苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV)等。

发明人在2014年4-10月对我国山东，辽宁和北京樱桃园的35个样品病毒进了常规的RT-PCR检测，结果表明CVA与CGRMV,CGRMV与LChV-1,CVA与ACLSV,CGRMV,LChV-1存在复合侵染现象(部分结果已发表在卢美光，吴冰，高蕊，等.我国部分地区樱桃病毒病害初步调查和病原检测.植物保护，2015,41(1):98-103.)，未检测到CNRMV。有必要研究可以同时鉴别检测这四种樱桃病毒的快速检测手段。

关于樱桃病毒检测的现有技术，目前国内外已有3篇关于樱桃病毒多重RT-PCR报道，包括同时检测樱桃CVA,PNRSV,CNRMV,LChV-1四种病毒,同时检测樱桃PNRSV,PDV,LChV-2,CGRMV四种病毒和同时检测樱桃PNRSV,PDV,LChV-2三种病毒的报道，其中对CVA,PNRSV,CNRMV,LChV-1四种病毒的多重RT-PCR的报道是基于室内对四种病毒人工混合进行的研究，没有这四种病毒混合感染的田间样品。

RT-PCR检测方法是樱桃病毒检测的重要和常用的技术。多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR,mRT-PCR)是PCR技术的发展，是对两个以上不同病毒基因位点的同时扩增，是一种较为快速、简便、经济的检测方法，目前，已应用到多种植物病毒的检测。该方法用于樱桃病毒复合感染的样品的检测是一种不错的选择。但对不同植物不同病毒组合的mRT-PCR检测体系均各不相同，必须对引物进行筛选，对引物浓度，样品cDNA浓度及PCR体系进行优化才能建立一套同时扩增多病毒基因的稳定的检测方法。

发明内容

根据上述领域存在的不足，本发明提供一种可同时检测侵染樱桃的CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种病毒的多重RT-PCR检测方法及其试剂盒。本发明请求保护的技术方案如下：

用于检测樱桃病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含独立包装或者混装在一起的如下的四对引物：

CVA-F：5’-TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3’，

CVA-R：5’-TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3’；

ACLSV-F：5’-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3’，

ACLSV-R：5’-GTCTACAGGCTATTTATTATAAG-3’；

CGRMV-F：5’-AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3’，

CGRMV-R：5’-GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3’；

LChV-1F：5’-GGTTGTCCTCGGTTGATTAC-3’，

LChV-1R：5’-GGCTTGGTTCCATACACTTC-3’。

所述樱桃病毒为CVA,ACLSV,CGRMV和/或LChV-1。

所述多重PCR试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的所述四对引物，四对引物的摩尔比为：CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1＝1：11.25：0.5：10。

用于检测樱桃病毒CVA的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：

CVA-F：5’-TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3’，