[发明专利]检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于CYP2C9基因rs1057910和VKORC1基因rs9923231多态位点的快速检测。

背景技术

华法林是目前国内外最常用的长效香豆素类口服抗凝药，也是目前唯一在临床上使用的维生素K拮抗剂，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病以及心脏人工瓣膜置换术和人工血管移植术等术后抗凝治疗，作为重要的口服抗凝药已经在临床使用接近60年。但华法林的有效治疗范围较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，除了受患者年龄、性别、体重、体表面积、营养状态、肝肾功能、饮食及使用药物等临床因素的影响外，华法林的代谢酶CYP2C9*3(1075A→C，rs1057910)和作用靶点VKORC1(-1639 G→A，rs9923231)的遗传多态性是主要的影响因素，而当前确定华法林需求剂量时无法考虑遗传因素的影响，常常造成患者严重的出血并发症。

华法林在体内的用药剂量主要是经肝脏CYP2C9调整，该酶是肝脏中一种重要的药物用药剂量酶，大约10％的临床常用药物由CYP2C9代谢，CYP2C9基因上存在多个遗传多态性位点，国外的研究表明CYP2C9 *2、*3突变与华法林药效相关，但*2突变在中国人群中基本不存在，所以本研究主要针对*3突变进行，即rs1057910位点的A＞C多态性。该位点突变后的酶活性仅为野生型的5％，这种突变降低了酶活性使其底物的清除率降低，血药浓度升高，携带CYP2C9突变基因的个体在使用华法林的初期就有较高的出血危险性，因此，需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。CYP2C9基因rs1057910位点多态性的人群分布频率约是AA(93％)、AC(6％)、CC（1%）。

华法林是维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的特异性抑制剂，VKOR主要由维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)基因编码，该基因上的多个多态性位点与华法林维持剂量存在相关性，VKORC1 1639GA、VKORC1 1173CT、VKORC1 3730AG基因型两两间存在连锁不平衡，其中VKORC11639G→A（rs9923231位点）多态性是影响华法林需求剂量中种族差异和个体差异的最主要因素，G基因的VKORC1启动子活性比A基因的启动子活性高出44％，这会引起VKORC1 mRNA表达增加，VKOR生成也相应增多，使有活性的氢醌型维生素K生成和凝血因子生成增加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效果。

通过对CYP2C9和VKORC1基因检测，能够快速确定华法林剂量范围，保证疗效，减少出血风险。把华法林的基因检测结果和INR监控相结合，可以更有效、迅速地调整华法林维持剂量，从而在达到疗效的同时减少华法林的出血风险。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR-Taqman MGB（Minor Groove Binder）探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。

如：1）直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%）。同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易实施等缺点。

2）普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1;14(3):163-9, United States Patent 20120135406]。

3）芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。