[发明专利]消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。

背景技术

脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，原来是由羊膜包卷着卵黄囊和尿膜的柄状伸长部而形成的。脐带中动静脉是通过尿膜的血管形成，卵黄囊的血管即形成脐肠系膜动脉及脐肠系膜静脉。当卵黄囊及其血管退化，脐动脉和脐静脉就发达起来，在这些间隙中可以看到疏松的胶状的间充质。脐带是母体和胎儿的血液间进行CO₂和O₂、代谢废物和营养物质交换的地方。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将O₂和营养物质从胎盘运送给胎儿，最后由子宫静脉将来自胎儿的代谢废物运走。

而某种激素和抗体等亦通过脐带从母体移交给胎儿，但运行机制尚未清楚。通过体外培养分离和培养脐带上皮细胞，可对脐带上皮细胞的增殖特性，母婴之间的某些激素和抗体的运转及机制等进行研究。同时，分离出人脐带上皮细胞，也可应用于人体烧伤皮肤的恢复应用，具有深远的医学研究意义。

目前，并无人脐带上皮细胞分离的相关技术方案，参考其他组织的上皮细胞分离方案，均采用组织块培养法来分离上皮细胞。

专利申请号为CN201210113304.X的发明报道了一种山羊乳腺上皮细胞的建系方法，山羊乳腺上皮细胞的分离与纯化为：

(一)山羊乳腺上皮细胞的分离

(1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的DPBS溶液洗涤一遍；

(2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成1mm³小块，用移液器吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持1cm²左右；

(3)37℃、5％CO₂、饱和湿度下倒扣干涸培养6～12h，期间勿翻动；

(4)上述(3)倒扣干涸培养结束后，添加2mL乳腺上皮细胞培养液，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下正置培养；

(5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4～6mL，自接种组织块72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8～10mL；以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10％FBS+1％ITS+10ng/mLEGF；

(二)山羊乳腺上皮细胞的纯化

(6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80～90％汇合时，吸取培养基，DPBS洗涤2遍；

(7)加入乳腺上皮细胞消化液于37℃、5％CO₂、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细胞消化液的成分包括0.02％EDTA和0.25％Trypsin；

(8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽；

(9)迅速再次加入上述消化液于37℃、5％CO₂、饱和湿度下消化；

(10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终止培养液终止消化；传代比例始终保持1∶2；所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/F12+10％FBS；

(11)重复(7)～(11)步骤，直至成纤维细胞去除干净。

专利申请号为CN201410176073.6的发明提供了一种前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，具体步骤包括：

第一步：将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到离心管中，并离心；

第二步：用原代细胞培养液重悬组织并转移到T-25培养瓶中，在37℃培养箱中培养1～2天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，2～3天后，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出；

第三步：用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞：或者，在倒置显微镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将间质细胞和组织块刮掉或将上皮细胞和组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞或间质细胞。