[发明专利]一种成品组织工程化骨的制备方法

权利要求书

1.一种成品组织工程化骨的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取骨髓的单个核细胞，扩增培养，得到单细胞悬液，所述细胞悬液的浓度为2.0×10⁶～2.0×10⁷/ml；

(2)然后将多孔支架浸润到所述单细胞悬液中，使单细胞悬液充分进入到多孔支架的内部，培养，得到细胞/支架复合体；然后将细胞/支架复合体接种到灌注式生物反应器中，加入培养基静置2～4小时后，对所述细胞/支架复合体进行连续灌注培养，得到组织工程化骨；

(3)对所述组织工程化骨进行初步清洗、深低温冷冻、病毒灭活、超声清洗、真空冷冻干燥、无菌包装以及辐照灭菌后，得到成品组织工程化骨。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述骨髓来源于志愿者髂骨，骨髓通过贴壁培养法或密度梯度离心法获得骨髓的单个核细胞。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述骨髓的单个核细胞为骨髓间充质细胞，所述单细胞悬液为第三代至第六代细胞的悬液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述多孔支架为多孔β-TCP支架、多孔羟基磷灰石支架或多孔珊瑚支架。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述单细胞悬液通过抽真空的方法充分进入所述多孔支架的内部，真空度为25.33～75.99Kpa。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述培养的时间为2～4小时，所述连续灌注培养的时间为14-28天。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述初步清洗是用生理盐水清洗的；所述深低温冷冻是在-80～-70℃，储存25～35天。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述病毒灭活是采用巴氏法病毒灭活方法，对组织工程化骨进行病毒灭活。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述真空冷冻干燥的真空度为1.3-13Pa，温度为-50～-10℃，时间为12～24小时。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述辐照灭菌是对无菌包装后的组织工程化骨，采用γ射线进行辐照灭菌，灭菌剂量为20～30kGy，无菌保证水平为(SAL)≤10^-6。