[发明专利]一种成品组织工程化骨的制备方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种成品组织工程化骨的制备方法。

背景技术

由于各种原因，特别是严重创伤、大块骨肿瘤切除以及关节假体松动等造成的大块骨缺损的修复与重建，是目前骨科治疗中的一大难题。目前，治疗骨缺损的方法主要包括自体骨移植、异体骨移植、人工骨材料及金属内植物等。然而，自体骨移植会存在骨量有限、供区感染以及慢性疼痛等并发症；异体骨移植包括同种异体骨移植和异种异体骨移植，但是都存在着免疫排斥反应、强度不足及疾病传播等并发症，随着法律的完善，供体的获得必需经过患者的捐献，其来源也是越来越少；而人工金属内植物存在电解、腐蚀、无菌性炎症以及不可吸收及应力遮挡等缺点；人工骨材料目前种类较多，但是这些材料多是无机的，移植到体内仅仅能够起到支架作用，其诱导新骨形成的能力非常有限。

随着组织工程技术的发展，国内、外许多实验室，已初步在体外构建出组织工程化骨。构建的组织工程化骨既具有类似于骨小梁结构的无机成分，又有细胞分泌的胶原形成的有机成分和生物活性因子。因此，其在修复骨缺损过程中既有骨传导作用，又有骨诱导作用。体外构建的组织工程化骨的技术已经比较成熟，而且在修复实验动物骨缺损的研究中，其效果很好。然而，阻碍体外构建的组织工程化骨应用于临床的主要原因包括，(1)其构建阶段时间较长(约1个月)，过程相对复杂，临床医生在治疗各种原因造成的骨缺损时，不会在接诊病人后再等待组织工程化骨的构建，患者同样不愿意等待；(2)构建的组织工程化骨具有一定的免疫原性，植入人体内可能存在排异反应；(3)实验室构建的组织工程化骨的无菌程度不能得到很好的保障。

因此，如果想将体外构建的组织工程化骨成功地应用于临床，必须进行必要的前期处理，包括消除免疫原性、消毒以及无菌包装等成品化处理。经过该过程的前期处理，使其保留有促进骨修复的生物活性成份，具有骨传导和骨诱导作用，同时消除了其免疫原性，另外，可以保证其绝对无菌性并能长期保存，为组织工程化骨在临床上的广泛应用提供条件。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种成品组织工程化骨的制备方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种成品组织工程化骨的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取骨髓单个核细胞，扩增培养，得到单细胞悬液，所述单细胞悬液的浓度为2.0×10⁶～2.0×10⁷/ml；

(2)然后将多孔支架浸润到所述单细胞悬液中，使单细胞悬液充分进入到多孔支架的内部，培养，得到细胞/支架复合体；然后将细胞/支架复合体接种到灌注式生物反应器中，加入培养基静置2～4小时后，对所述细胞/支架复合体进行连续灌注培养，得到组织工程化骨；

(3)对所述组织工程化骨进行初步清洗、深低温冷冻、病毒灭活、超声清洗、真空冷冻干燥、无菌包装以及辐照灭菌后，得到成品组织工程化骨。

优选的，步骤(1)中，所述骨髓来源于志愿者髂骨，骨髓通过贴壁培养法或密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞。

优选的，步骤(1)中，所述骨髓单个核细胞为骨髓间充质细胞，所述单细胞悬液为第三代至第六代细胞的悬液。

优选的，步骤(2)中，所述多孔支架为多孔β-TCP(β-磷酸三钙)支架、多孔羟基磷灰石支架或多孔珊瑚支架。

优选的，步骤(2)中，所述单细胞悬液通过抽真空的方法充分进入所述多孔支架的内部，真空度为25.33～75.99Kpa(即，1/4个标准大气压～3/4个标准大气压)。

优选的，步骤(2)中，所述培养的时间为2～4小时，所述连续灌注培养的时间为14-28天。

优选的，步骤(3)中，所述初步清洗是用生理盐水清洗的。

优选的，步骤(3)中，所述深低温冷冻是在-80～-70℃，储存25～35天。

优选的，步骤(3)中，所述病毒灭活是采用巴氏法病毒灭活方法，对组织工程化骨进行病毒灭活。

超声清洗：利用超声波在清洗介质中产生的具有瞬时高温高压的微气泡将污物“击碎”，对组织工程化骨中的细胞碎片等杂质进行清洗。

优选的，步骤(3)中，所述真空冷冻干燥的真空度为1.3-13Pa，温度为-50～-10℃，时间为12～24小时。

优选的，步骤(3)中，所述无菌包装是采用三层无菌包装。

优选的，步骤(3)中，所述辐照灭菌是对无菌包装后的组织工程化骨，采用γ射线进行辐照灭菌，灭菌剂量为20～30kGy，无菌保证水平为(SAL)≤10^-6。