[发明专利]检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于乙醛脱氢酶2基因rs671多态位点的快速检测。

背景技术

有机硝酸酯类药物用于治疗心绞痛是通过释放一氧化氮（NO）介导的，乙醛脱氢酶2（ALDH2）具有硝酸酯酶活性，可以将有机硝酸酯脱硝形成一氧化氮，是有机硝酸酯药物发挥疗效的关键。如果病人ALDH2基因中携带有Glu504Lys（rs671）突变，变异基因编码的蛋白质结构具有差异，ALDH2的硝酸酯酶活性会降低10倍以上，突变型ALDH2 *2/2 是野生型ALDH2*1/1活性的 6–7%，突变型ALDH2*1/2是野生型ALDH2*1/1活性的 8–15%，因此ALDH2突变型酶Lys504不能迅速将有机硝酸酯转化为NO，导致心肌缺血情况加重，难以发挥药效。资料显示，亚洲人群约5%-30%的个体都携带有ALDH2*2/2或ALDH2*1/2突变。对于携带突变基因型（风险基因型）的患者，则不能完全把有机硝酸酯类药物当作心绞痛发作时的唯一药品，因此，本试剂盒的适用人群为预期使用有机硝酸酯类药物的患者，检测ALDH2基因型可预知含服有机硝酸酯类药物的风险，为医生合理使用有机硝酸酯类药物提供参考。

此外，ALDH2基因的rs671 G＞A型突变，直接导致ALDH2在乙醇代谢途径中乙醛脱氢成乙酸时活性的大幅度下降，使饮酒者体内乙醛大量储积，乙醛的毒性会使饮者头痛，全身发红，加重肝脏负担。科学研究发现这种突变还会增加人体患多种肿瘤尤其是食道癌的风险，因此，本试剂盒还可适用于了解酒精代谢能力及酒精对身体危害程度的人群。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR-Taqman MGB（Minor Groove Binder）探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。

如：1）直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%）。同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易实施等缺点。

2）普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1;14(3):163-9, United States Patent 20120135406]。

3）芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。

4）PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低，但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]。

5）PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见 [J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15；United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量较少(≥1,000个中的1个)的等位基因或突变位点。

6）PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染，而且操作步骤多，费时费力。