[发明专利]一种云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoss的检测引物和方法

说明书

技术领域

本发明属于云纹石斑鱼（Epinephelus moara）DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoss的技术方法，具体是云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoss的检测方法。

背景技术

云纹石斑鱼（Epinephelus moara）属鲈形目、鮨科、石斑鱼属，俗称草斑、油斑，分布于北太平洋西部，我国产于东海和南海。它肉味鲜美，口感爽滑，蛋白质含量高，营养丰富，深受广大消费者青睐。云纹石斑鱼生长快、适应性强、经济价值高、适应于池塘、网箱和室内工厂化养殖。但云纹石斑鱼自然资源量少，难以满足人们的需求。2010年，中国水产科学研究院黄海水产研究所、福建省水产研究所与烟台市莱州明波水产公司联合攻关，首次在我国北方获得规模化繁育成功，为北方开展石斑鱼养殖奠定了坚实的基础。云纹石斑鱼已成为我国目前最具发展潜力的海水养殖新品种之一。云纹石斑鱼作为一种新兴的养殖品种，遗传学研究相对薄弱，还没有微卫星标记开发的报道。虽然同工酶标记、RAPD标记及AFLP标记技术也可以用于研究云纹石斑鱼的遗传结构及其遗传多样性，然而由于这些标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低， RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。但由于缺乏云纹石斑鱼微卫星标记，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取微卫星标记以进行云纹石斑鱼遗传多样性、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高多态性的云纹石斑鱼DNA分子遗传标记技术，即云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoss的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。

本发明的基本构思主要是利用云纹石斑鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测云纹石斑鱼每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物（微卫星标记Epinmoss）对云纹石斑鱼的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从云纹石斑鱼DNA序列中获取了一个微卫星标记，命名为Epinmoss，该微卫星标记Epinmoss可用于云纹石斑鱼遗传多样性分析和系谱认证。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先提取云纹石斑鱼血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用云纹石斑鱼基因组DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对云纹石斑鱼不同地理群或云纹石斑鱼群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得云纹石斑鱼的遗传多态性图谱。

提取云纹石斑鱼基因组DNA，将其稀释为100ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。

含有微卫星序列的DNA序列为：

cgtggattat gcctgagagt atagtgtatt aacccctagg agagaacaaa

gcacctcatg gttaggagag ccagagacct tgccagtgtg tgtgtgtgtg

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtatg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt

tctggaatgc ctggagacct ggacctgtgg gacaaggggc cttaatccat

gagcat

其中微卫星核心序列为：gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtg tgtgtgtatggtgtgtgtgtgtgtgtgtgt

Epinmoss微卫星引物序列为：

正链5’- CGTGGATTATGCCTGAGAGTATAGT-3’，

负链5’-ATGCTCATGGATTAAGGCCCCTTGT-3’，使用该引物时的退火温度为56℃。

微卫星核心序列和引物序列是本发明的核心，在云纹石斑鱼遗传多样性检测中呈现多态性。