[发明专利]一种病毒样颗粒的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种病毒样颗粒的纯化方法。

背景技术

目前常见的疫苗种类有基因工程亚单位疫苗，DNA疫苗，病毒样颗粒疫苗，减毒活疫苗。其中，病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制。由于，VLPs和天然病毒形态相似，很大程度上保持了蛋白的自然结构，且VLP抗原决定簇及表位与真正的病毒没有本质区别，因此可以诱导激发较强的细胞免疫及体液免疫。并且，由于VLPs不含有病毒基因组核酸，因此具有相对较高的安全性。目前，VLPs疫苗被认为最具有潜力的疫苗。

虽然病毒样颗粒与活病毒有相似的形态学结构，但病毒样颗粒蛋白的性质可能与活病毒有差异，由于病毒样颗粒组装成的空间结构是什么能力使其形成正二十面体结构目前还不是很清楚，并且其大小与杆状病毒大小相近。这就给病毒样颗粒制备过程中的纯化带来了很多困难。

现有研究结果表明，选用常规的离子交换层析很难将目的蛋白与杂蛋白分离开来，对VLPs的纯化通常需要经过多个步骤。然而，在纯化过程中，每增加一个步骤就会对待纯化物造成一定的损失，步骤越多，收率越低。而病毒样颗粒的产生大多通过昆虫或酵母表达系统获得，如纯化方式不当，则很难获得病毒样颗粒，这无疑限制了病毒样颗粒疫苗的广泛应用。

羟基磷灰石是由钙和磷酸盐成的化合物。陶瓷羟基磷灰石(CHT)中，磷酸离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可由NaCl浓度梯度或磷酸钠浓度梯度洗脱，其中的Ca²⁺离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，该结合方式对NaCl不敏感，可由磷酸、钠浓度梯度洗脱。羟基磷灰石因陶瓷化工艺不同分为2种类型：I型和II型。现有研究结果认为，陶瓷羟基磷灰石I型对蛋白质具有更大的保留，对酸性蛋白质具有更大的动态载量，因此，陶瓷羟基磷灰石I型主要用于纯化大部分蛋白质(分子量一般在100kd以下)；陶瓷羟基磷灰石II型由于孔径较I型大，因而对抗体和部分 重组疫苗等大分子量蛋白质的动态载量更高，而对HSA几乎无保留，因而陶瓷羟基磷灰石II型更适合于抗体的纯化，同时II型对核酸具有更大的保留，能够分辩单、双链、超螺旋等各种高级结构的DNA，因而也适合纯化核酸但目前普遍认为，陶瓷羟基磷灰石在纯化过程中损失量过高，因此，尚无将陶瓷羟基磷灰石应用于病毒样颗粒的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种病毒样颗粒的纯化方法。该方法回收率高、制得的病毒样颗粒纯度大。

本发明提供的病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。

由于陶瓷羟基磷灰石具有良好的捕捉力和选择性，能够分离其他介质不能分离的各种比较难分离的，性质比较接近的生物分子，因此，采用CHT纯化能够大大减少纯化步骤，且所得产物纯度较高。尽管如此，现有研究结果表明，采用陶瓷羟基磷灰石层析的方法纯化样品损失量较高，收率较低，因此，陶瓷羟基磷灰石层析通常不适用于纯化浓度低、含量少的物质。而病毒样颗粒通常通过真菌或昆虫细胞表达产生，其产量通常较低，因此目前尚未有将陶瓷羟基磷灰石层析用于病毒样颗粒的纯化。本发明采用CHT层析，将病毒样颗粒与CHT特异性吸附，经洗脱去除大部分大分子蛋白和杂质蛋白。在本发明的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的填料为CHT I型。

在本发明的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。

在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L，pH值为8.5。

作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.5mol/L

在另一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，pH值为8.0。

作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.4mol/L。

在本发明的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为1mol/L；pH值为7.0～8.5。

在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液的pH值为8.0。