[发明专利]一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(Lateral Flow Assay)检测牛传染性鼻气管炎病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。

背景技术

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起的牛传染性鼻气管炎，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上呈多种表现类型，特别是该病能引起免疫抑制，继发性的细菌感染能导致更严重的呼吸道疾病。目前此病在世界范围内广泛流行，且该病严重影响着国际牛业生产贸易，已被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传播性疾病。我国于20世纪70年代末从新西兰进口的奶牛中检测到IBRV，由于没有很好的免疫防护措施，随后我国多数省份的牛群中均有此病毒感染，对牛群的肥育、产奶和繁殖影响极大，给牛场造成巨大的经济损失。目前对该病的诊断方法主要有病原分离、PCR方法、ELISA试验和血清中和试验等，由于这些方法需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。因而亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为临床现场检测及疫情监测等提供新一代的检测技术与手段。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是一种不同于PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶三种酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链，对模板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5’荧光标记的探针，探针标记的荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶nfo识别切割，产生新的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信号与扩增产物的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析试纸条上显示。

目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于IBRV检测的报道。本发明系首次采用RPA技术建立快速检测IBRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为IBRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

发明内容

针对RPA技术应用于IBRV检测领域的空白，本发明提供了一种准确、快速、简便检测IBRV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒DNA粗提取并进行RPA等温扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于非实验室环境下临床现场检测，具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于通过RPA技术检测IBRV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

正向引物：5’-TTCCGACCAGCGCCGAATCTTGGATGCAGTACT-3’；(SEQ ID No.1)

反向引物：5’-GGCCAAAACCGCTTTCAGAAGCAGAGCAAGGTGA-3’(5’-端用Biotin标记)；(SEQ ID No.2)

探针序列：5’-CCGCAAAGTGCCGAGGGATGTCCTTGTAGT【dSpacer】CAGGTCCACCTTCCGCT-3’(探针5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断)。