[发明专利]基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

权利要求书

1.一株基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751/lox-DPE，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015258。

2.权利要求1所述的基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括含有来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704的DPE酶基因的整合载体pDGI-7S6-P43-DPE；再利用整合载体pDGI-7S6-P43-DPE将DPE酶基因和抗生素抗性基因lox71-spc-lox66整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上，然后利用Cre重组酶敲除染色体上的spc抗性基因，获得一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）以整合载体pDGIEF为出发载体，将质粒p7S6用SalⅠ/XmaⅠ双酶切得到lox71-spc-lox66片段；将整合载体pDGIEF用SalⅠ/XmaⅠ双酶切，将lox71-spc-lox66片段连入相应酶切位点，得到新的整合载体pDGI-7S6；

（2）设计引物将DPE酶基因扩增出来，在引物中引入NheⅠ/SalⅠ酶切位点，通过重叠延伸PCR将启动子P43融合在DPE酶基因上游，将扩增的DPE酶基因连接至pMD-19T中，得到质粒T-P43-DPE；

（3）将整合载体pDGI-7S6和T-P43-DPE同时用NheⅠ/SalⅠ双酶切，将P43-DPE表达基因构建至整合载体pDGI-7S6中，得到整合载体pDGI-7S6-P43-DPE；

（4）将整合载体pDGI-7S6-P43-DPE转入枯草芽孢杆菌1A751感受态，发生同源重组，P43-DPE表达基因和lox71-spc-lox66整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上，得到1A751-P43-DPE-spc；

（5）将温敏性质粒pTSC导入整合的重组枯草芽孢杆菌1A751-P43-DPE-spc中，在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在Cre酶的作用下，lox71和lox66位点发生重组，抗生素抗性基因spc被删除，提高温度培养，pTSC质粒丢失，获得一株无抗性基因的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于为增强表达，在DPE基因的上游添加启动子P43，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中1-300位所示。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于整合载体pDGI-7S6-P43-DPE，其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因、作为筛选标记的抗生素抗性基因lox71-spc-lox66片段以及淀粉酶同源臂amyE。

6.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE的应用，其特征在于可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品和制药领域中的应用。