[发明专利]基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

说明书

技术领域

一种基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种DPE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属于酶基因工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（DPE酶）属于D-塔格糖 3-差向异构酶（简称DTE）家族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。目前，DPE酶可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。

随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要的经济价值的当务之急。D-阿洛酮糖是一种天然己酮糖，D-阿洛酮糖拥有蔗糖甜度的70%，能量值却只有蔗糖的0.3%，具有较高的溶解度，较低的血糖反应。因此它是一种理想的甜味剂，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品。此外D-阿洛酮糖还可以减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。

自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，近年来通过新技术开发可实现其大规模生产。D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、食品安全性等问题。而通过D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase , DPEase, EC 5.1.3.30)把D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的生物转化法因具有反应简单、产物单一、纯化步骤容易等优点而逐渐吸引了众多科学家的关注，也成为D-阿洛酮糖商业化生产的热点和焦点。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。Bacillus subtilis表达系统没有明显的密码子偏好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作，并且遗传背景研究比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。

发明内容

本发明目的是提供一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的食品级安全的重组枯草芽孢杆菌，并可用于转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。对D-阿洛酮糖的食品生产具有重要的意义。

本发明的技术方案：一株基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751/lox-DPE，分类命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015258。

所述的基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括含有来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704的DPE酶基因的整合载体pDGI-7S6-P43-DPE；再利用整合载体pDGI-7S6-P43-DPE将DPE酶基因和抗生素抗性基因lox71-spc-lox66整合至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtils )1A751染色体上，然后利用Cre重组酶敲除染色体上的spc抗性基因，获得一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。

重组菌的制备方法，其具体步骤为：

（1）以整合载体pDGIEF(NCBI-Gene ID: 86278326)为出发载体，将质粒p7S6用SalⅠ/XmaⅠ双酶切得到lox71-spc-lox66片段；将整合载体pDGIEF用SalⅠ/XmaⅠ双酶切，将lox71-spc-lox66片段连入相应酶切位点，得到新的整合载体pDGI-7S6。