[发明专利]人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，该试剂盒包括第一试剂包和第二试剂包，所述第一试剂包和第二试剂包各自包含PCR缓冲液，dNTP，MgCl₂，特异性探针，锁核酸引物，内标系统，HotStartTaq酶、UNG酶，其中第一试剂包包含引物对SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，探针SEQIDNO:3，第二试剂包包含引物对SEQIDNO:1和SEQIDNO:4，探针SEQIDNO:5，其中SEQIDNO:4为锁核酸引物。

2.如权利要求1所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，其特征在于，探针SEQIDNO:3、SEQIDNO:5的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，所述荧光基团可以为FAM、VIC或HEX。

3.如权利要求1所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，其特征在于，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物序列为SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，所述内标探针序列为SEQIDNO:8。

4.如权利要求3所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，其特征在于，所述内标探针5’端修饰有VIC，3’端修饰有TAMRA。

5.如权利要求1所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，其特征在于，第一试剂包和第二试剂包中均含有ROX参比校正。

6.如权利要求1所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有V600E突变质粒DNA，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

7.一种简单快速检测人类BRAF基因V600E突变的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选含有人类BRAF基因质控的引物、探针，含有BRAF基因V600E突变的检测探针，ARMS引物，通用引物；

(2)获得待测样品基因组DNA；

(3)取权利要求1-6中任一项所述的检测试剂盒，将所述基因组DNA先后取相同的量加入所述第一试剂和所述第二试剂中并同时进行PCR反应，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

8.一种检测人类BRAF基因V600E突变的方法，该方法利用权利要求1至6任一项所述的检测试剂盒进行，该方法包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)将上述获得的基因组DNA先后取同样量分别加入含有本发明的检测试剂盒中第一试剂包的PCR反应体系和含有本发明的检测试剂盒中第二试剂包的PCR反应体系中，并使该两个反应体系同时进行PCR反应，两个PCR反应彼此独立进行，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，根据以下条件进行所述判断：

△Ct<9则待测样品存在BRAF基因V600E突变；△Ct值≥9则待测样品无BRAF基因V600E突变或突变丰度低于本试剂盒突变检测下限。

10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，还包括对上样量是否合适进行判断的步骤，判断依据如下：

Ct₀≤32则上样量合适，检测结果有效；Ct₀>32则上样量偏低，需增加上样量后重新检测，

其中，所述Ct₀为所述第一试剂包对应的Ct值。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述△Ct值≥9的情况包括所述第二试剂包进行PCR反应后无Ct值的情况。

12.如权利要求7-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应条件为：

95℃5～10min；

95℃15～30s，60℃45～60s，40～45个循环。

13.如权利要求7-11中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应条件优选为：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，45个循环。

14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，V600E检测体系还能够很好的对V600其他突变模板进行区分，包括V600K,V600D,V600R,V600M突变模板。