[发明专利]人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类BRAF基因V600E突变检测的试剂盒，尤其涉及一种快速有效地检测少量样本的BRAF基因V600E突变的试剂盒。

背景技术

BRAF基因，全名为v-Raf鼠肉瘤病毒原癌基因同系物B1(v-RafmurinesarcomaviraloncogenehomologB1)，是1988年由IKawa等在诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞的转化过程中发现并克隆确认的，与ARAF、CRAF同属于RAF基因家族，位于人染色体7q34，大小约为190kb，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。

BRAF突变发生在近8％人类肿瘤中，主要发生于结肠直肠癌、黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中。据统计，约15％的结肠癌患者中存在体细胞BRAF基因突变。11％的突变位于外显子11上的甘氨酸环；89％的突变发生于外显子15上的激活区，其中约92％位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代(V600E)。有研究指出，对于KRAS基因野生型但同时具有BRAFV600E突变的结肠直肠癌患者，使用抗EGFR抗体靶向治疗无效。2011年《NCCN结肠直肠癌临床实践指南》建议应对KRAS基因野生型患者进一步检测其BRAF基因型。

表1：BRAF基因V600E突变

目前针对基因突变的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(HighResolutionMeltingAnalysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测缺失突变效果较差，准确度不高。因此，需要建立一种快速有效的检测人类BRAF基因V600E突变检测的方法。

发明内容

本发明目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。

本发明提供了一种人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括第一试剂包和第二试剂包，所述第一试剂包和第二试剂包各自包含PCR缓冲液，dNTP，MgCl₂，特异性探针，锁核酸引物，内标系统，HotStartTaq酶、UNG酶，其中第一试剂包包含引物对SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，探针SEQIDNO:3，第二试剂包包含引物对SEQIDNO:1和SEQIDNO:4，探针SEQIDNO:5，其中SEQIDNO:4为锁核酸引物。

在本发明的一些实施方案中，探针SEQIDNO:3、SEQIDNO:5的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。

在本发明的一些实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物序列为SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，所述内标探针序列为SEQIDNO:8。

在本发明的一些实施方案中，所述内标探针5’端修饰有VIC，3’端修饰有TAMRA。

在本发明的一些实施方案中，第一试剂包和第二试剂包中均含有ROX参比校正。

在本发明的一些实施方案中，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有V600E突变质粒DNA，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

本发明的人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒可以于简单快速检测基因多态性，所述检测包括以下步骤：(1)设计并筛选含有人类BRAF基因质控的引物、探针，含有BRAF基因V600E突变的检测探针，ARMS引物，通用引物；(2)获得待测样品基因组DNA；(3)取权利要求1-5中任一项所述的检测试剂盒，将所述基因组DNA先后取相同的量加入所述第一试剂包和所述第二试剂包中并同时进行PCR反应，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

本发明的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因突变情况；2.可以准确检测10ng基因组DNA样本中0.1％的BRAF基因突变；3.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在两个反应管中检测同一样本，操作简便，能在90分钟内完成检测结果判读方法简单客观，便于分析。