[发明专利]人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的试剂盒，尤其涉及一种快速有效地检测少量样本的CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒。

背景技术

华法林是目前临床上使用最早、最多、最广的口服抗凝药，已被应用于多种疾病的抗凝治疗,如静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等，但临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，尤其是在使用华法林抗凝治疗初期，极易导致严重的出血并发症。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。

华法林有两种构象：R和S。其中S-华法林的作用占60～70％，而R-华法林只有30～40％。S-华法林主要由CYP2C9代谢成无活性的代谢产物。CYP2C9的基因多态性决定了华法林的使用剂量。有荟萃分析显示,患者携带CYP2C9*2或CYP2C9*3变异需要一个较低的华法林维持剂量,尤其携带有CYP2C9*3突变的患者表现更为明显,大约减少30％的剂量。

突变导致CYP2C9酶活性降低，其活性仅为野生型的5％，这种突变降低了酶活性，使其底物的清除率降低，血药浓度升高，因此，需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。VKORC1基因是华法林作用靶点，目前已经有了一系列VKORC1基因多态与华法林剂量的报道。在亚洲人群中研究结果显示，VKORC1的基因多态对华法林剂量差异的影响达到了49.5％，其中VKORC1基因-1639G>A位点，G和A等位基因的发生频率分别为80.5％和19.5％。与A等位基因相比，G等位基因增加了近40％的酶活性，从而可能引起华法林剂量的差异。

人工机械瓣膜置换术患者必须进行抗凝以预防血栓栓塞的形成，而华法林是常用抗凝药。华法林治疗窗窄，临床中华法林每日维持剂量在不同个体间可以相差20倍，引起致命性和严重出血发生率分别为1.3％和7.2％，对患者生命健康构成极大威胁。CYP2C9和VKORC1基因突变可解释约50％的华法林用药剂量个体差异，对指导华法林合理应用具有巨大的指导意义。

近年来随着分子生物学的快速发展，大量研究表明，在中国，华法林代谢酶基因CYP2C9基因*3等位基因型和华法林靶点基因VKORC1基因-1639G/A基因型与其抗凝疗效密切相关，不同基因型患者所需华法林剂量差异明显。美国FDA于2007年对华法林的说明书进行了更新，强调医护工作者要使用基因检测来调整不同个体病人的合理初始药剂量，从而达到辅助优化华法林使用的目的，并降低出血风险。

本发明试剂盒对人类CYP2C9基因CYP2C9*3位点和VKORC1基因VKORC1-1639G>A位点的多态性进行定性检测，可辅助医生对华法林药物使用剂量及毒性反应进行预测。

表1：CYP2C9和VKORC1基因多态性

目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(HighResolutionMeltingAnalysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本的CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法。

发明内容

本发明目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测CYP2C9和VKORC1基因多态性，其灵敏度高，特异性强，可适用于用于EDTA、柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆中提取的人类基因组DNA的检测。

本发明提供了一种CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，HotStartTaq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统。

在本发明的一些实施方案中，所述2组特异性引物序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2与SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5与SEQIDNO:6。