[发明专利]一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌

权利要求书

1.一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，其特征在于，是将重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的编码天冬氨酸转氨酶的基因aspC、编码芳香族氨基酸转氨酶的基因tyrB和编码异亮氨酸转氨酶的基因ilvE进行敲除，解除了菌株本身对PPA的降解，所述aspC的序列如GeneID8182318所示，tyrB的序列如GeneID 8179723所示，ilvE的序列如GeneID 8182196所示。

2.一种构建权利要求1所述重组菌的方法，其特征在于，PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上、下游各1000bp的核苷酸及抗性标记片段，通过融合PCR制备打靶片段，将打靶片段转化大肠杆菌感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株，再消去抗性。

3.一种应用权利要求1所述重组菌全细胞转化生产α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，将L-苯丙氨酸4-6g/L、全细胞催化剂1.2-1.5g/L，在pH 8.0的20mM Tris-HCl中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h，所述全细胞催化剂的获得，是将权利要求1所述的重组菌按1-2％接种量接种到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达，诱导5h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液洗两遍菌体即得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/LKH₂PO₄和72mmol/L K₂HPO₄的溶液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸4-5g/L，全细胞催化剂1.2-1.5g/L，反应在pH 8.0的20mM Tris-HCl中进行，37℃，200rpm转化6-10h。