[发明专利]一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，属于生物技术领域。

背景技术

α-苯丙酮酸(PPA)有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物中间体。PPA还可用于制备苯乳酸，苯乳酸可作为抗菌物质。目前PPA生产主要是化学合成法，主要包括：乙酰氨基肉桂酸水解法、乙内酰脲与苯甲醛合成法和海因法。这些方法均需经过多步反应，对反应条件有较高要求，例如高压、高温等，产品得率低，对后期分离纯化加大了难度，易产生有毒有害产物。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。

L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。Proteus mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。

全细胞转化相比分离酶具有如下优势：易制备，成本低；更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；无污染，副产物少。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。之前的研究中我们已经成功构建了大肠杆菌全细胞催化剂，表达来源于P.mirabilis KCTC2566的脱氨酶基因，PPA的产量为3.3g/L。本发明旨在进一步提高PPA产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，解除了菌株本身对PPA的降解，从而提高胞外转化L-苯丙氨酸的效率。

所述重组菌是将重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的aspC(编码天冬氨酸转氨酶，GeneID 8182318)、tyrB(编码芳香族氨基酸转氨酶，GeneID 8179723)和ilvE(编码异亮氨酸转氨酶，GeneID 8182196)基因敲除，从而阻断胞内PPA的分解途径。

所述重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的构建方法参见发明名称为“一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法”，申请号为201310392427.6的专利申请。

所述aspC、tyrB和ilvE基因敲除方法：PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上下游约1000bp及抗性标记片段约1000bp，通过融合PCR制备打靶片段。将打靶片段转化大肠杆菌感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株，再用温敏型质粒消去抗性。

本发明还提供一种应用所述重组菌全细胞转化生产α-苯丙酮酸的方法，将L-苯丙氨酸4-6g/L、全细胞催化剂1.2-1.5g/L，在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h。

所述全细胞催化剂的获得，是将含有L-氨基酸脱氨酶突变体的重组大肠杆菌按1-2％接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体即得。

发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH₂PO₄和72mmol/L K₂HPO₄的溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54g的K₂HPO₄溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌)。