[发明专利]一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法，属于水体污染检测领域。一种检测水体中鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg2+溶液和ddH2O，该巢式PCR方法使用两轮PCR扩增，检测方法如下：提取水样DNA，以其为模板进行第一轮PCR扩增，引物为SCF、SCR，反应结束后，以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，引物为NCF、NCR，结束后，琼脂糖凝胶电泳检测403bp条带存在表明水体收受到鸡粪污染。该方法通过巢式PCR扩增，大大增加了检测的灵敏度，可以检测到水中存在的微量鸡粪污染，并且具有良好的特异性，可直接应用于水体粪便污染检测及防治工作中。

技术领域

本发明涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种检测粪便污染水体中鸡粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

近年来，我国水体污染日趋严重，威胁着人们的生存环境和健康用水，并对社会造成了严重的经济损失。太湖流域畜禽养殖业发达，养殖业废水是造成太湖流域水体污染的主要来源之一。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成富营养化，并且会带入粪便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播(Baldursson,S.and Karanis,P.(2011)Waterborne transmission of protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks‐An update 2004‐2010.Water Research 45(20),6603‐6614.)。进行水体污染的控制和治理已经刻不容缓。

粪便污染的潜在污染源种类繁多，呈现点、面源结合的特征，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作只停留在“见污治污”阶段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分水体中粪便污染主要来源，从而快速、准确地确定污染源，成为了解决问题的关键。传统方法通过检测水中粪便污染指示菌(如大肠杆菌、肠球菌等)来判断水体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或化学标志物，可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不高，往往导致假阳性结果的产生。2000年，Pierre等最先证实粪便中的线粒体DNA(mtDNA)具有其种属特异性，并且动物粪便中含有较高丰度的mtDNA，通过PCR手段能够检测到明显的mtDNA信号，因此提出了“水体粪便污染的mtDNA溯源方法”(Caldwell,J.,Payment,P.andVillemur,R.(2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of FecalContamination.)。

以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有力的工具。通过特异性引物PCR扩增水体中的目标线粒体DNA片段，即可检测样品是否受到潜在的粪便污染，用时短且准确度高。另外通过设计特异性的巢式PCR引物进行二次扩增，极大的提高了方法的灵敏度，能够检测到水体中的微量粪便污染。