[发明专利]牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测引物及检测方法

权利要求书

1.牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述引物为针对牦牛MyHC I基因序列的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，针对牦牛MyHC IIA基因序列的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，针对牦牛MyHC IIX基因序列的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，牦牛MyHC IIB基因序列的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

2.牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，是取牦牛肌组织进行总RNA提取并检测RNA纯度和浓度后，将总RNA反转录成cDNA并以牦牛GAPDH基因为内参基因进行质量检测，再以权利要求1所述的引物进行荧光定量PCR反应，同样以牦牛GAPDH基因为内参基因进行统计分析即可。

3.根据权利要求2所述的牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述牦牛MyHC I基因序列为SEQ ID NO.9，牦牛MyHC IIA基因序列为SEQ ID NO.10，牦牛MyHC IIX基因序列为SEQ ID NO.11，牦牛MyHC IIB基因序列为SEQ ID NO.12。

4.根据权利要求3所述的牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以牦牛MyHC基因的mRNA序列作为模板设计如权利要求1所述的特异性引物；

2）从牦牛肌肉组织样品中提取总RNA并检测RNA纯度和浓度：

A）、取100mg牦牛背最长肌组织，用液氮磨成粉末装入1.5m1的EP管，加1ml裂解液RZ；

B）、将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

C）、4℃，13400×g离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；

D）、加入200μl氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3min；

E）、4℃，13400×g离心10min，样品分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA在水相中，水相的体积为所用裂解液RZ试剂的50%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；

F）、缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃， 13400×g离心30sec，弃掉收集管中的废液；

G）、向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，13400×g离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中；

H）、向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW，室温静置2 min，4℃，13400×g离心30sec，弃废液；

I）、重复操作步骤H；

J）、将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，13400×g离心2min，去除残余液体；

K）、将吸附柱CR3转入一个新的1.5 ml离心管中，加50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃，13400×g离心2 min；

L、将回收产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28SrRNA 量为18SrRNA 的两倍，说明RNA完整性好；利用Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD260、OD280及OD260/OD280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA OD260/OD280读数在1.8-2.1之间；

3）总RNA反转录成cDNA并进行质量检测：

4）荧光定量PCR反应；

利用实时荧光定量仪检测MyHC基因在牦牛背最长肌中的 mRNA 表达水平，实时PCR反应总体系25μl，包括：

SYBR Premix Ex Taq^TM ，12.5μl；

上游引物S，浓度20 mmol·L^-1 ，1μl；

下游引物A，浓度20 mmol·L^-1，1μl；

ddH₂O，9.5μl；

cDNA 模板，1μl；

反应程序为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，40个循环后进入溶解曲线程序；

5）荧光定量PCR统计分析：

以GAPDH基因作为内参，每个样品做3个重复，获得平均Ct值，以 2^-ΔΔCt 法计算得到目的基因的相对表达量，各型肌纤维比例的换算为以不同亚型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在全部肌纤维中的比例，计算公式如下：

MyHC_(i)＝[MyHC_(i)/(MyHC I+MyHC IIA+MyHC IIX+MyHC IIB)]×100%。