[发明专利]牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肌纤维类型的检测引物及检测方法领域，具体涉及牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测引物及检测方法。

背景技术

牦牛是分布在青藏高原为中心及其毗邻的高山、亚高山地区的牛种，为牧民提供奶、肉、毛、役、燃料等生产和生活资料，具有“高原之舟”的美称。牦牛常年采食天然牧草，其肉的蛋白质含量高，脂肪含量低，且富含不饱和脂肪酸及特殊的风味物质，是符合现代生活要求的绿色食品(阎萍，2012)，其肉品质性状一直是牦牛遗传育种领域研究的热点。

肌纤维是骨骼肌的主要组成成分，肌纤维类型的差异会导致骨骼肌生理与代谢特征上的差异，进而引起肌肉品质的差异，是影响肌肉品质的重要因素。肌纤维类型主要有三种分类方式：第一类是依据骨骼肌形态与生理差异进行分类；第二类是利用组织化学方法对肌纤维进行分类；第三类是目前最常用的分类方式，基于肌球蛋白重链（MyHC）不同的亚基结构进行分类(Bottinelli et al., 2000)。随着分子生物学技术的发展，基于mRNA的检测方法开始广泛应用于肌纤维的分类和定量，该方法在一定程度上克服了传统方法的不足，具有简单、高效、准确等特点。多项研究表明荧光定量PCR(Q-PCR) (Kuang et al., 2014; Zhang et al., 2014)方法可以准确检测出四种MyHC亚型，分别是I、IIA、IIX和IIB型，并预测各种类型肌纤维的含量(Talmadge et al., 2014; Zhang et al., 2014)。目前对于牦牛肌纤维类型的研究，相对较少，没有建立一种有效的牦牛肌纤维类型组成的检测方法。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，基于不同类型的肌球蛋白重链基因，设计特异引物，并测定mRNA表达量，进而分析不同类型肌纤维的含量，提供了一种比组织化学评定更为准确、可靠以及操作简单的牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测引物及检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测引物，所述引物为针对牦牛MyHC I基因序列的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，针对牦牛MyHC IIA基因序列的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，针对牦牛MyHC IIX基因序列的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，牦牛MyHC IIB基因序列的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

本发明的第二个目的是提供了牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测方法，是取牦牛肌组织进行总RNA提取并检测RNA纯度和浓度后，将总RNA反转录成cDNA并以牦牛GAPDH基因为内参基因进行质量检测，再以权利要求1所述的引物进行荧光定量PCR反应，同样以牦牛GAPDH基因为内参基因进行统计分析即可。

进一步的，上述的牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测方法，所述牦牛MyHC I基因序列为SEQ ID NO.9，牦牛MyHC IIA基因序列为SEQ ID NO.10，牦牛MyHC IIX基因序列为SEQ ID NO.11，牦牛MyHC IIB基因序列为SEQ ID NO.12。

进一步的，上述的牦牛肌纤维类型组成的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1）以牦牛MyHC基因的mRNA序列作为模板设计如上所述的特异性引物；

2）从牦牛肌肉组织样品中提取总RNA并检测RNA纯度和浓度：

A）、取100mg牦牛背最长肌组织，用液氮磨成粉末装入1.5m1的EP管，加1ml裂解液RZ；

B）、将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

C）、4℃，13400×g离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；

D）、加入200μl氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3min；

E）、4℃，13400×g离心10min，样品分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA在水相中，水相的体积为所用裂解液RZ试剂的50%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；

F）、缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃， 13400×g离心30sec，弃掉收集管中的废液；

G）、向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，13400×g离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中；

H）、向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW，室温静置2 min，4℃，13400×g离心30sec，弃废液；