[发明专利]一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用在审
申请号: | 201510305970.7 | 申请日: | 2015-06-04 |
公开(公告)号: | CN104987360A | 公开(公告)日: | 2015-10-21 |
发明(设计)人: | 张树彪;赵轶男;崔韶晖;陈会英;周泉 | 申请(专利权)人: | 大连民族学院 |
主分类号: | C07K5/11 | 分类号: | C07K5/11;C07K1/06;C12N15/87 |
代理公司: | 大连一通专利代理事务所(普通合伙) 21233 | 代理人: | 郭丽华 |
地址: | 116600 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一类 双烷氧酰胺 烷基 阳离子 肽脂质 及其 合成 方法 应用 | ||
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别是涉及一类非病毒基因载体及制备方法。
技术背景
随着人们在细胞水平上对疾病发病机制认识的不断深入,基因治疗已日渐成为科学家们研究的热点。基因治疗是通过向靶细胞或组织引入外源基因DNA或RNA片段,来纠正或补偿基因的缺陷,关闭或抑制异常基因的表达,从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为一种新的治疗手段,可以治疗多种疾病,包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病,其中癌症基因治疗是其主要应用领域。用于基因转运的载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体如重组腺病毒载体,这类载体由于转染效率较高且对大多数细胞都具有靶向作用,因此在基因转运方面具有一定的优越性。但它会引起体内的一些免疫反应,而且含有可转录的病毒基因,可能在体内发生基因的重组或互补,进一步对人体造成伤害。非病毒载体与之相比虽然转染效率有限,但是具有无传染性、不限制载体容量、化学结构可控以及可大量制备等优点而越来越受到研究者的青睐。
阳离子脂质体具有类细胞结构和生物膜的特性,在体内可降解,可以保护其运载基因片段的生物活性,是一种有临床应用潜力的非病毒基因转染载体。脂质体的这种结构可以压缩基因形成复合物,递送至病变组织或细胞。自从1987年Felgner等首次利用N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)对COS-7等细胞进行成功转染后,脂质体已经发展成为除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法,特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。但由于其仍存在一定的局限性,如细胞毒性大,对器官的靶向性不明显,基因转运机制不明确等限制了其广泛应用。因此,人们一直致力于对阳离子脂质体的各种构建及化学修饰,试图寻求一种高效低毒的基因治疗药物。
脂质体发展的近30年来,从广泛使用的季铵盐头部、胍基头部到多胺头部阳离子脂质,已经形成了比较完善的脂质体载体系统,但这些载体系统仍然存在许多问题,如介导基因的转运效率还有待提高;对靶组织无定向识别性;阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞后,核酸被束缚于内涵体中,释放困难,不利于在细胞质或细胞核中表达,从而无法达到治疗目的。中国专利CN103613516A,2014-03-05公开了一类双子型阳离子类脂的制备及其在药物或基因转运中的应用,该载体由于具有双头部结构生物降解性较差而存在一定的细胞毒性,因此在体内基因转染方面受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一类细胞毒性小,在体外和体内基因转染效率高的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用。
本发明的技术方案为:
一、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及制备方法
1、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质,其化学结构由通式I表示:
其中:
x选自1~6,最优选2~4;
y选自1~8,最优选2~4;
R选自C8-20烷基,该烷基包括直链烷基和支链烷基;
AA选自精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、鸟氨酸(Orn)或赖氨酸(Lys);
B选自鸟氨酸(Orn)或赖氨酸(Lys)。
2、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质的合成方法,是以氨基保护的氨基酸制备肽头部中间体;以酰化试剂和醇类化合物进行酰化,酰化产物再与多胺类化合物反应,制备双长碳链中间体;将制备的肽头部中间体与制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接;将保护基团脱掉,再与氨基保护的氨基酸进行反应,脱保护后得到所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物。
具体步骤如下:
(1)以酰化试剂对醇类化合物进行酰化,所述酰化试剂为羰基二咪唑;所述醇类化合物为十二醇、十四醇、十六醇或十八醇;所述酰化试剂与醇类物质的摩尔比为1:10~10:1,反应溶剂为甲苯、二氯甲烷、DMF或氯仿,反应温度为10~60℃,反应时间为0.5~12h;
(2)酰化产物再与多胺类化合物反应,制备双长碳链中间体。所述多胺类化合物为二乙烯三胺、二丙烯三胺或二丁烯三胺等多胺,多胺与酰化产物摩尔比为1:2~1:8;催化剂为三乙胺、碳酸钠或甲基吡啶等,催化剂的加入量为多胺投料质量的10%,反应温度为10~100℃,反应时间为2~48h,经重结晶得到带有双长碳链的中间体N,N-双烷氧酰胺烷基胺,所述重结晶溶剂为乙酸乙酯或无水乙醇/水混合溶剂(v/v=5:1);
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