[发明专利]一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法

权利要求书

1.一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，在植入育珠蚌的珠核表面粘附有一层厚度均匀的可降解高分子聚合物作为组织工程支架，所述组织工程支架为一个可以容纳细胞生长的立体网络空间，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离的外套膜细胞，配制成一定细胞密度的外套膜细胞悬液，然后将珠核粘附外套膜细胞后与外套膜细胞悬液一起植入育珠蚌的插核位置来培育有核珍珠。

2.根据权利要求1所述的用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其包括以下步骤：

（1）珠核表面预处理：将珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态；

（2）制备珠核组织工程支架层模具：所述模具由模具Ⅰ和模具Ⅱ组成，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，而位于棱另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有凹槽的组织工程支架珍珠核；

模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核；

（3）配制组织工程支架液：无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0wt%~3.0wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀；

先将步骤（1）处理好的珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤⑶制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀，室温下静置6~24小时使胶原蛋白交联，降温至4℃、10分钟后使珠核脱模；然后打开模具Ⅰ取出珠核，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹槽的凹口处对准注胶孔，再注入步骤3）制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在-20 ℃条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥2~24小时，真空度为12~20 Pa，冻干温度为-20~-70℃，将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗多次以充分洗尽戊二醛；常温真空干燥抽去水分，将珠核浸泡于蚌血清或牛血清或马血清溶液中30分钟，在-20 ℃条件下冷冻2~4小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥1~24小时，真空度为12~20 Pa，冻干温度为-20~-70℃；

（4）外套膜游离细胞获取：清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1mm²小块，采用胰酶消化法消化组织块，采用浓度为0.25wt%的胰酶溶液，在25~37℃范围内消化0.5~4小时，用200 目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，得到珍珠蚌的外套膜组织游离细胞；

（5）珠核植核前预粘附细胞：将分离出的外套膜组织游离细胞用培养液或PBS稀释成每毫升1.0×10⁵~1.0×10⁷个细胞的细胞悬液，将处理过的珠核浸泡到细胞悬液中；

（6）用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口， 并制造通道，先向通道中滴加部分步骤（5）制备的细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出；

（7）将经过步骤（6）手术插核处理的育珠蚌吊养于育珠水域, 按常规的饲养管理规范进行操作。

3.根据权利要求1所述的用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，其中所述的高分子聚合物指的是生物可降解天然高分子材料和生物可降解的合成高分子材料，所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖或透明质酸；所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚己内酯或聚乙烯醇。