[发明专利]一种酶融合表达蛋白及其在虾青素生产方面的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白Lycopene lyclase-linker-CrtW和外源基因的表达及其应用，属于基因工程和合成生物学技术领域。

背景技术

虾青素，是一种类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，呈深粉红色，化学结构类似于β-胡萝卜素。虾青素广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼、藻体、酵母和鸟类的羽毛中含量较高，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一。因此，在自然界，虾青素具有最强的抗氧化性。

由于两端的羟基(-OH)旋光性原因，虾青素具有3S-3'S、3R-3'S、3R-3'R(也称为左旋、内消旋、右旋)这3种异构型态，其中人工合成虾青素为3种结构虾青素的混合物(左旋占25％、右旋占25％，内消旋50％左右)，极少抗氧化活性，鲑鱼等养殖生物体内的虾青素(以反式结构——3S-3’R型为主)，酵母菌源的虾青素是100％右旋(3R-3'R)，有部分抗氧化活性。只有藻源的虾青素是100％左旋(3S-3'S)结构，具有最强的生物学活性。

目前市场上的虾青素主要由化学方法合成，但化学合成虾青素的可吸收性和抗氧化能力都比天然虾青素低。天然虾青素能在某些微藻、细菌和真菌中产生，动物和植物一般不能合成虾青素，但虾、鲑鱼、鳟鱼等水生动物能通过摄食这些微生物在体内积累虾青素。目前天然虾青素生产主要利用水产品废弃物以及红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)和雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)等微生物。而随着植物基因工程技术的发展，利用转基因为虾青素生产开辟了一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合蛋白。

本发明的另一目的在于提供所述融合蛋白的用途，用于减少虾青素生产过程中中间产物的量，进而提高虾青素的生产效率。

实现本发明目的的技术解决方案是：一种融合蛋白，包括:(1)β-茄红素环化酶；(2)β-胡萝卜素羰基化酶；(3)位于(1)和(2)之间的由60个氨基酸构成的连接肽。

所述β-胡萝卜素羰基化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列；所述β-茄红素环化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

编码所述β-茄红素环化酶和β-胡萝卜素羰基化酶的氨基酸序列之间连接有多肽接头的氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的序列。

编码所述融合蛋白的核苷酸序列是SEQ ID NO.5所示的序列。

表达该融合蛋白DNA的载体为pBluescript II(-)上插入目的基因命名为phl-107，如下所示：

本发明中的目标蛋白均带有标记，所述标记分别为His-tag和Strep-tag，标记基因序列分别加到引物的5’端，通过pcr反应使其与目标基因相连，并将目的基因的终止密码子转移到标记基因末端。

与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)本发明利用基因工程技术实现两种酶蛋白的融合，实现了双酶功能的成功整合。

(2)本发明利用该融合蛋白直接将茄红素转化为角黄素，然后和羟基化酶(CrtZ)反应生成虾青素，减少中间产物的合成，提高合成效率。

附图说明

图1为本发明中对照组实验虾青素提取物的HPLC图，a图为标准虾青素保留时间，b图为实验所得虾青素保留时间，1，2，3分别代表β-茄红素，角黄素和虾青素。

图2为本发明中实验组实验虾青素提取物的HPLC图，a图为标准虾青素保留时间，b图为实验所得虾青素保留时间，1，2，3分别代表β-茄红素，角黄素和虾青素。

具体实施方式

本发明的构思是：由于茄红素经过环化酶反应后生成的β-胡萝卜素既能和羰基化酶(CrtW)反应也能和羟基化酶(CrtZ)反应，β-胡萝卜素先和羟基化酶反应后生成玉米黄素，玉米黄素很难再和羰基化酶反应生成虾青素，因此融合蛋白的方法就是让茄红素经环化酶生成β-胡萝卜素后能立即遇到羰基化酶，直接将茄红素转化为角黄素。然后将角黄素转化为虾青素，转化效率大大提高。