[发明专利]H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株及其构建方法和应用

权利要求书

1.H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株rTX-NS1-128，其特征在于，它是以A/chicken/Taixing/10/2010TX株为母本，对NS1基因的长度进行缺失，使得NS1蛋白只保留了128个氨基酸；所述的128个氨基酸的序列如SEQ ID NO.15所示。

2.权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株rTX-NS1-128，其特征在于通过如下方法得到：是以A/chicken/Taixing/10/2010TX株为母本，以NS基因全长引物NS-1和NS-2反转录PCR扩增NS基因，克隆至-T载体，构建出阳性质粒pCR2.1-TX-NS，以pCR2.1-TX-NS为模板，组合使用引物NS-1和NS-128-OL-R，以及NS-128-OL-F和NS-2分别扩增出NS基因上段和下段条带；将上下两段以1:1混合后作为模板使用引物NS-1和NS-2扩增出NS-128全长基因；将此基因克隆至-T载体，构建阳性质粒pCR2.1-TX-NS1-128；将pCR2.1-TX-NS1-128与转录表达质粒pHW2000分别用Bsm I酶切后进行连接构建转录表达质粒pHW2000-TX-NS1-128；将获得的转录表达质粒共转染禽流感病毒许可的宿主细胞，收获转染后细胞上清液接种鸡胚尿囊腔获救重组病毒rTX-NS1-128；其中，所述引物序列如下：

NS-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG；

NS-2：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT；

NS-128-OL-F：ACAAAAACATCTAGGAAGGAGCAAT；

NS-128-OL-R：ATTGCTCCTTCCTAGATGTTTTTGT。

3.权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株rTX-NS1-128的构建方法，其特征在于，是以A/chicken/Taixing/10/2010TX株为母本，以NS基因全长引物NS-1和NS-2反转录PCR扩增NS基因，克隆至-T载体，构建出阳性质粒pCR2.1-TX-NS，以pCR2.1-TX-NS为模板，组合使用引物NS-1和NS-128-OL-R，以及NS-128-OL-F和NS-2分别扩增出NS基因上段和下段条带；将上下两段以1:1混合后作为模板使用引物NS-1和NS-2扩增出NS-128全长基因；将此基因克隆至-T载体，构建阳性质粒pCR2.1-TX-NS1-128；将pCR2.1-TX-NS1-128与转录表达质粒pHW2000分别用Bsm I酶切后进行连接构建转录表达质粒pHW2000-TX-NS1-128；将获得的转录表达质粒共转染禽流感病毒许可的宿主细胞，收获转染后细胞上清液接种鸡胚尿囊腔获救重组病毒rTX-NS1-128；其中，所述引物序列如下：

NS-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG；

NS-2：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT；

NS-128-OL-F：ACAAAAACATCTAGGAAGGAGCAAT；

NS-128-OL-R：ATTGCTCCTTCCTAGATGTTTTTGT。

4.权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株rTX-NS1-128在制备广谱性H9N2亚型AIV减毒活疫苗中的应用。