[发明专利]一种水稻的育种方法

权利要求书

1.一种水稻的育种方法，包括以下步骤：

a)采用CTAB法提取野生菰DNA；

b)用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，获得酶切野生菰DNA；

c)采用花粉管通道法将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种；

所述限制性内切酶为HindⅢ和EcoRⅠ；

所述的育种方法中步骤a)具体为：

a1)取野生菰幼叶，用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，加入1倍CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min；

a2)向步骤a1)获得的溶液中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；

a3)向步骤a2)获得的上清液中加入CTAB缓冲液、体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；

a4)向步骤a3)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；

a5)向步骤a4)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％冷乙醇-40℃冰箱中沉淀2h后离心；

a6)将步骤a5)获得的沉淀用冷乙醇洗一次，自然干燥后，用TE缓冲液溶解，加入RNA酶贮存缓冲液处理后，获得野生菰DNA。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述2倍CTAB提取缓冲液包括：2％CTAB、100mMTris、20mM pH值为8.0的EDTA、1.4M NaCl和1％的分子量为40000的PVP。

3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述高盐缓冲液包括：10mM pH值为8.0的Tris、1mM pH值为8.0的EDTA和1M NaCl。

4.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，1倍TE缓冲液包括：10mM pH值为8.0的Tris、1mM pH值为8.0的EDTA；RNA酶贮存缓冲液包括：1mg/ml RNaseA和100U/ml RNaseT1。

5.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤b)包括：

用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，酶切后的DNA用冷乙醇-40℃下过夜，离心，得到的沉淀干燥后用1倍SSC缓冲液溶解，获得酶切野生菰DNA。

6.根据权利要求5所述的育种方法，其特征在于，所述1倍SSC缓冲液包括：150mMNaCl,15mMpH值为8.0的C₆H₉Na₃O₉。

7.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤c)为：

在水稻开花1～3h，切柱头1/3～2/3，然后在切口处滴入步骤b)获得的酶切野生菰DNA溶液，浸泡去掉柱头的子房，将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。

8.根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，所述酶切野生菰DNA溶液的浓度为100-200μg/ml。