[发明专利]重组G-CSF(15-75)多肽载体的构建及表达方法

权利要求书

1.一种重组G-CSF15-75多肽的载体，其特征在于，所述的载体含有重组的G-CSF15-75基因序列，所述的重组G-CSF15-75 的基因序列如SEQ NO ：1所示。

2.根据权利要求1 所述重组G-CSF15-75 多肽的载体，其特征在于，所述的G-CSF15-75基因序列SEQ NO ：1，其5′端加EcoR Ⅰ酶切位点和kex2 酶切位点，3′端加TAA 终止密码子和Not Ⅰ酶切位点。

3.根据权利要求1 所述重组G-CSF15-75 多肽的载体，其特征在于，所述的G-CSF15-75多肽含有G-CSF15-75 的活性必需的二硫键，其氨基酸序列如SEQ NO ：2 所示。

4.一种毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述的菌株为巴斯德毕赤酵母菌（pichiapastoris）G-CSF15-75 CGMCC NO ：10713。

5.根据权利要求4 所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于它是被权利要求1 所述的载体转化GS115 获得的阳性表达菌株。

6.如权利要求4 或5 所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，具体制备步骤如下：

(1) pPIC9K-G-CSF15-75 重组质粒的制备：pPIC9k 与权利要求1 所述的重组G-CSF15-75基因经双酶切后通过T4 连接酶连接，得到重组质粒pPIC9K-G-CSF15-75；

(2) 限制性内切酶Sal I 将重组质粒pPIC9K-G-CSF15-75 线性化，然后电转化到毕赤酵母菌GS115 中得到毕赤酵母重组菌株。

7.根据权利要求1所述重组G-CSF15-75 多肽的载体，其特征在于，所述的G-CSF15-75基因表达多肽的相对分子量为6.5KD。

8.根据权利要求1所述重组G-CSF15-75 多肽的载体，其特征在于，表达的G-CSF15-75多肽蛋白经纯化达到电泳纯，其纯品的生物学比活性为1.5×10⁸IU/mg。

9.一种权利要求1所述的重组G-CSF15-75多肽的载体的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求4的毕赤酵母菌重组菌株，经过发酵诱导表达，经过phenyl sephrose 6fast flow 疏水层析柱纯化，再经过DEAE sephrose fast flow 层析柱纯化，最后通过Superdex75 层析柱纯化。

10.如权利要求4 所述的毕赤酵母重组菌株在生产粒细胞刺激因子的应用。