[发明专利]重组G-CSF(15-75)多肽载体的构建及表达方法

说明书

本发明公布了一种重组G‑CSF多肽(15‑75)的载体构建及其在毕赤酵母中进行高效表达的方法，所述重组载体是将G‑CSF多肽(15‑75)基因克隆入pPIC9K表达载体，转化毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达重组G‑CSF多肽。本发明构建的pPIC9K‑G‑CSF‑GS115重组毕赤酵母菌可以高效稳定的表达重组G‑CSF多肽(15‑75)，目的蛋白的表达量在2.8g/L以上，经纯化的重组G‑CSF多肽(15‑75)纯度达99.8％，生物学比活性为1.5×10⁸IU/mg。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种G-CSF(15-75)多肽的表达载体构建及其在毕赤酵母菌中的表达。

背景技术

粒细胞刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的主要作用是刺激中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化，增加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞功能，化疗后肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。

G-CSF于1991年被美国FDA投放市场，用于治疗放疗后中性粒细胞减少症，现在已经有多家在生产销售，并且开发出大肠杆菌表达复性的人G-CSF蛋白上市，长效的PEG 化的G-CSF也获得FDA的批准，国内开发的G-CSF二聚体F-627也已完成Ⅱ期临床，并取得较好的效果。

中国专利CN03132702.3中公开了表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的酵母重组株及rhGM-CSF的纯化方法，其中将克隆修饰的M-CSF基因插入pGAPZa-A的载体中，最后表达产物的比活性在3.4×10⁷IU/mg以上。

中国专利CN103233053A中公开了一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，采用重组质粒pKG931作为表达载体，以大肠杆菌HB101作为受体菌，提高生产效率，蛋白纯度为95％左右，但是获得了重组人粒细胞刺激因子的表达量仅仅有50％。

中国专利CN103114115中公开一种一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法，其药物组合物及制剂选用重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行发酵培养；对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后低温离心；包涵体中加入包涵体溶解液，4℃条件下8～12小时后，离心得到包涵体提取液；采用SephacrylS-200凝胶柱对提取液进行分离，收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子馏分；再采用SephadexG25柱进行分离，最终得到的的高纯度、高活性的G-CSF，但回收率只有47.5％。

中国专利CN103233053中该开一种一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其中公开了大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，均采用含酵母和蛋白胨的无抗生素培养基，采用高压均质机破菌，经过变性、复性和层析，得到G-CSF表达量为50％。

目前，国内生产的G-CSF大多数为大肠杆菌表达产物，使用大肠杆菌在生产过程中需要复性，且复性率低，比活性也相对较低；使用聚乙二醇修饰的G-CSF，其生物活性会下降；酿酒酵母工程菌株的表达属于非整合性表达，表达过程不稳定、产物表达量低和基因容易丢失的缺陷。

发明内容

针对以上缺陷，本发明的目的之一在于提供一种重组的表达G-CSF(15-75)多肽载体及其该载体构建、表达方法，本发明通过对G-CSF(15-75)基因进行优化，该多肽含有 G-CSF生物功能所必需的活性中心，优化后的多肽片段较小，表达量在2.8g/L以上，且比活性为1.5×10⁸IU/mg以上。

本发明的第二个目的在于提供优化后G-CSF(15-75)基因以及优化后该基因编码的氨基酸序列。