[发明专利]一种基于携带His标签重组抗原的发光免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验专业的抗体检测技术领域，主要包括过敏原抗体、病原体抗体和自身抗体，尤其是涉及一种基于携带His标签重组抗原的发光免疫检测方法。

背景技术

免疫化学(抗原-抗体反应)技术是检测特异性抗体的重要方法，即采用已知抗原检测未知抗体方式。酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法常用于检测上述抗体，也可采用酶联斑点印迹试验(dot-ELISA)以“线性方式”同时包被多种相关抗原，以实现同时检测多种抗体(如抗核抗体谱、HIV感染确认试验等)。上述两种方法的基本原理如下：用已知抗原包被固相载体(聚苯乙烯微孔板或硝酸纤维素膜)；加待检血清温浴，待检抗体与已知抗原结合形成免疫复合物(或待检抗体被固相抗原捕获)；再加酶标记抗体并温浴，标记抗体与待检抗体结合，未结合抗体通过“洗涤”去除；最后加底物显色，终止酶促反应后用酶标仪读取吸光度值(A)或直接观察膜表面斑点判定结果。

实际应用中发现上述方法存在一些技术方面的缺陷，而这些缺陷影响检测结果准确性或给商业化生产带来某些困难，主要表现在以下方面：

其一、固相化问题固相吸附分离是非均相酶免疫分析常用分离技术，其原理是将抗原固相在固相材料表面(聚苯乙烯微孔或硝酸纤维膜)，与待检抗体和酶标抗体形成的抗原-待检抗体-酶标抗体复合物存在于固相材料表面，而游离标记物分布于液相中。倾倒液相溶液并通过“洗涤”可轻松去除干扰测定的、游离的酶标记抗体。然而，已知抗原与固相材料连接后(包被)，分布于固相材料表面的抗原分子，其结构不再具有液相中的天然构象。这种分子构象的变化必将影响已知抗原与待检抗体结合；同时，固相抗原位于固相材料表面，因空间位阻效应会严重影响与待检抗体结合。此外，当包被抗原为分子量较小的多肽分子时，常会因包被过程失去其生物活性，或结合抗体能力显著下降。

其二、包被抗原纯度和多种抗原组合的问题固相包被是将抗原包被在固相平面上，微孔板或硝酸纤维膜的包被面积有限，用于包被的抗原要求较高的纯度，而抗原纯化过程会增加检测试剂盒的生产成本。同时，无论过敏原sIgE抗体，还是病原体抗体或自身抗体，一般需要多种蛋白作为已知抗原，而上述固相包被方式并不适合多重抗原同时进行包被。多重抗原包被涉及组分之间比例和空间位阻造成的相互干扰。

其三、制备过程和使用过程复杂无论酶联免疫吸附试验还是酶联斑点印迹试验，抗原固相化过程是诊断试剂生产的关键环节，抗原包被-封闭-干燥等过程较复杂，实现标准化需要标准操作程序并严格执行。从用户角度看，上述两种检测试剂的使用也比较复杂，临床标本需要稀释、两次温育和多次洗涤过程需要很长时间，且标记抗体(酶)受多种因素影响等，也不利于操作者的使用。

针对上述技术方面的缺陷，本技术发明涉及一种基于携带His标签的已知重组抗原，采用活性氧能力传递均相发光免疫分析原理，建立一种新型发光免疫分析体系，用于特异性IgE、病原体抗体和自身抗体检测。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种基于携带His标签重组抗原的发光免疫检测方法，采用活性氧能量传递均相发光免疫分析原理，将已知重组抗原置于液相三维空间，与传统技术固相化抗原存在本质区别，本发明建立一种新型发光免疫分析体系，用于特异性IgE、病原体抗体和自身抗体检测，具有更高的分析敏感度和精密度，且制备工艺简单，操作方便。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种基于携带His标签重组抗原的发光免疫检测方法，包括如下步骤，

1)获得His-重组蛋白；

2)将待检血清、His-重组蛋白溶液、His抗体包被的发光微球溶液充分混匀，并于37℃温浴30～45min；

3)温浴后，经高速离心10～15分钟，弃上清；

4)加入生物素标记的第二抗体溶液和链霉亲和素包被的感光微球溶液，充分混匀，37℃温浴15～30min；

5)用光激发发光检测仪在615nm下检测光信号。

所述His-重组蛋白，上游(左端)携带His标签，下游是待检抗体所针对的重组蛋白(已知抗原)，重组蛋白带有不同抗原表位(如图示含有3种抗原表位)，此重组蛋白可捕获待检抗体。

所述生物素标记的第二抗体，标记有生物素分子，因待检抗体为人免疫球蛋白，可使用兔抗人IgE(用于检测IgE类抗体)或兔抗人IgG(用于检测IgG类抗体)。

所述链霉亲和素包被感光微球，感光微球与生物素结合，同时携带感光物质，用激光照射时可产生活性氧分子。