[发明专利]一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法

权利要求书

1.一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法，包括以下步骤：

1)微电泳槽的制作和表面改性：用玻璃刀沿光滑载玻片的宽将载玻片划成20～25个25mm×3mm×1mm的窄条；然后将这些窄条用中性玻璃胶贴到干净的光滑载玻片上，围成正方形小槽，即为微电泳槽；微电泳槽的表面改性采用镀膜法，即微电泳槽在2g/L的正常熔点琼脂糖浸没1min后，置37℃孵箱烘烤2～12h；

2)原生质体的制备：将藻培养液离心，去上清液，藻细胞悬浮于酶解液中，使藻细胞密度为10⁷个/mL，25℃避光保温1.5h；1000×g离心1min，然后用同体积0.55mol/L甘露醇洗涤一次，再次离心后轻柔悬浮于0.55mol/L甘露醇中；

所述的酶解液为0.55mol/L甘露醇加入20g/L纤维素酶和10g/L离析酶，pH 5.8；

3)包埋细胞：将悬浮于甘露醇中的细胞与熔化的浓度是7.5～10g/L低熔点琼脂糖混匀，使100μL低熔点琼脂糖凝胶中含有4000～5000个细胞，平铺于微电泳槽中；

4)细胞裂解：将包埋好藻细胞的微电泳槽放在表面皿中，加入藻细胞裂解液，液面没过微电泳槽，4℃避光裂解1～2h；

所述的细胞裂解液为2.5mol/L NaCl，100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris，pH 10，1％Triton X-100，10％DMSO；

5)酶解：利用特异性识别DNA损伤并将受损的DNA切割成DNA断片的核酸内切酶按1:10³～1:10⁴倍数进行稀释，37℃酶解30～45min；

6)碱解旋：将包埋有藻细胞的微电泳槽置于碱性电泳液中4℃解旋20～40min；

7)电泳，中和，干燥和染色，拍照与结果分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述的中性玻璃胶为包含3％～5％硅酸钠的中性玻璃胶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)中，所述的DNA损伤，嘌呤碱基氧化损伤用甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶检测，嘧啶碱基氧化损伤用核酸内切酶III检测，UV造成的cis-syn型环丁烷嘧啶二聚体DNA损伤用T4核酸内切酶V检测。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6)中，所述的碱性电泳液的配方为：300mmol/L NaOH，1mmol/L Na₂EDTA，pH 13。