[发明专利]一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法

说明书

技术领域

本发明涉及单细胞检测技术，特别提供了一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法。

背景技术

单细胞凝胶电泳又称彗星实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单、双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。

尽管单细胞凝胶电泳具有较高的灵敏度和优越性，以往利用该方法检测浮游藻细胞DNA损伤时也存在诸多问题。Erbes等人于1997年第一次将单细胞凝胶电泳运用于基因毒性化合物引起的单细胞绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的DNA损伤(Erbes et al.,1997)。该方法通过对Singh等人(1988)的实验流程进行改进，主要改动是利用含有离子型去污剂的碱性裂解液和缩短碱解旋和电泳的时间。不幸的是，该方法在Erbes等人报道之后再无人报道(Panáková,2001)。等人对该现象进行了推测，认为利用该方法对莱茵衣藻的DNA损伤进行检测存在如下一些技术难点：(1)细胞壁的存在导致细胞裂解效率低下的问题；(2)在细胞核周围存在物理或生物屏障，使得产生“彗星”拖尾现象发生率低；(3)存在“彗星”图像观察和DNA损伤定量的困难(et al.,2004)。

发明内容

本发明的目的是克服单细胞凝胶电泳在浮游藻细胞DNA损伤检测方面的障碍，提供了一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法，该方法特别适用于淡水绿藻细胞，方法简单，结果清晰，线性关系良好。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法，包括以下步骤：

1)微电泳槽的制作和表面改性：用玻璃刀沿光滑载玻片的宽将载玻片划成20～25个25mm×3mm×1mm(长×宽×厚)的窄条。然后将这些窄条用中性玻璃胶(包含3％～5％硅酸钠)贴到干净的光滑载玻片上，围成正方形小槽，即为微电泳槽。微电泳槽的表面改性采用镀膜法，即微电泳槽在2g/L的(常规分析用)正常熔点琼脂糖浸没1min后，置37℃孵箱烘烤2～12h。

2)原生质体的制备：将藻培养液离心，去上清液，藻细胞悬浮于酶解液中(使藻细胞密度约为10⁷个/mL)，25℃避光保温1.5h。1000×g离心1min，然后用同体积0.55mol/L甘露醇洗涤一次，再次离心(1000×g，1min)后轻柔悬浮于0.55mol/L甘露醇中。

所述的酶解液为0.55mol/L甘露醇加入20g/L纤维素酶和10g/L离析酶，pH 5.8。

3)包埋细胞：将悬浮于甘露醇中的细胞与熔化的低熔点琼脂糖(浓度是7.5～10g/L)混匀，使100μL低熔点琼脂糖凝胶中含有4000～5000个细胞，平铺于微电泳槽中；

4)细胞裂解：将包埋好藻细胞的微电泳槽放在表面皿中，加入藻细胞裂解液，液面没过微电泳槽，4℃避光裂解1～2h。

所述的细胞裂解液为2.5mol/L NaCl，100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris，pH 10，1％(V/V)Triton X-100，10％(V/V)DMSO。