[发明专利]一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法

权利要求书

1.一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

提供肿瘤细胞，并进行培养；

使用盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行药物诱导，得到盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系；

使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARP1基因。

2.如权利要求1所述的多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，在所述使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARP1基因的步骤中，使用shRNA1、shRNA2、shRNA3核苷酸链进行慢病毒包装，感染所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系，其中，所述shRNA1、shRNA2、shRNA3核苷酸链序列包含六个区域，分别为：BamHⅠ酶切位点、19nt靶核苷酸序列、茎环结构、靶序列互补序列、RNA PolyⅢ聚合酶转录中止位点和EcoR I酶切位点。

3.如权利要求2所述的多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述shRNA1、shRNA2、shRNA3核苷酸链的序列分别为：

shRNA1Top：

5’-gatccGCAACAAACTGGAACAGATTTCAAGAGAATCTGTTCCAGTTTGTTGCTTTTTTACGCGTg-3’，

shRNA1Bottom:

5’-aattcACGCGTAAAAAAGCAACAAACTGGAACAGATTCTCTTGAAATCTGTTCCAGTTTGTTGCg-3’；

shRNA2Top：

5’-gatccGCAACAAACTGGAACAGATTTCAAGAGAATCTGTTCCAGTTTGTTGCTTTTTTACGCGTg-3’，

shRNA2Bottom：

5’-aattcACGCGTAAAAAAGCAACAAACTGGAACAGATTCTCTTGAAATCTGTTCCAGTTTGTTGCg-3’；

shRNA3Top：

5’-gatccGCGAGTACATTGTCTATGATTTCAAGAGAATCATAGACAATGTACTCGTTTTTTACGCGTg-3’，

shRNA3Bottom：

5’-aattcACGCGTAAAAAACGAGTACATTGTCTATGATTCTCTTGAAATCATAGACAATGTACTCGCg-3’。

4.如权利要求2所述的多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述慢病毒感染所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的方法为：

将所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系进行细胞培养后，加入含有所述慢病毒和凝聚胺的1640完全培养基中转染；

转染22-26h后去除含所述慢病毒的完全培养基，加入1640培养基继续培养；

用0.5-1.5μg/mL的嘌呤霉素对细胞筛选，获取存活细胞。

5.如权利要求2所述的多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述使用shRNA1、shRNA2、shRNA3核苷酸链进行慢病毒包装，包括以下步骤：

对所述shRNA1、shRNA2、shRNA3核苷酸链进行退火处理；

使用PLVX-SHRNA1构建PLVX.1慢病毒干扰载体，将所述PLVX.1慢病毒干扰载体分别与所述shRNA1、shRNA2、shRNA3核苷酸进行连接，分别得到重组载体PLVX-PARP1shRNA1、PLVX-PARP1shRNA2、PLVX-PARP1shRNA3；

将所述重组载体PLVX-PARP1shRNA1、PLVX-PARP1shRNA2、PLVX-PARP1shRNA3进行连接产物的转化，得到PLVX-PARP1shRNA重组质粒；

共转染所述PLVX-PARP1shRNA重组质粒，进行慢病毒包装。

6.如权利要求5所述的多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，将所述PLVX.1慢病毒干扰载体分别与所述shRNA1、shRNA2、shRNA3核苷酸进行连接的方法为：

按下述组分含量比例配制连接反应体系：

将上述连接反应体系在15-17℃条件下反应24小时以上。